氮源、碳源影響紅色糖多胞菌發酵的研究

張 萍，師文飛，黃文福，牛 春

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750100)

紅霉素( Erythromycin, Er)是由紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)合成的14元大環內酯類抗生素，又被稱為robimycin 或e-mycin，包括ErA～ErF[1]，其中ErA的抑菌活性最高。紅霉素具有廣譜抗菌作用，其抗菌譜與青霉素相似[2]，對革蘭陽性菌尤其敏感，對葡萄球菌、化膿性鏈球菌、綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、白喉桿菌等有較強的抑制作用，是治療耐藥性金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌感染而引起疾病的首選藥物，臨床上可用于治療對青霉素過敏的患者。近幾年紅霉素衍生物的興起，大大刺激了母體紅霉素的需求[3-4]。

我國紅霉素發酵水平屬低水平重復操作，與發達國家相比差距較大。目前國外發酵單位己達8000～12000 U/mL，而國內大多企業紅霉素發酵水平卻一直在4000～5000 U/mL[5]。紅霉素發酵水平主要受工作菌種、培養基組成、發酵條件控制以及后期的分離提純條件等多方面因素的影響，國內很多科技工作者從紅霉素發酵相關參數和調控入手，希望提高紅霉素發酵水平。對前期選育的一株高產紅霉素紅色糖多孢菌菌株培養基進行了響應面法優化，以使其更好的發揮菌株的生長特性，進一步提高發酵液中紅霉素產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 紅色糖多孢菌，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司技術研發中心菌種研究室選育、保藏的高產菌株EM15-15。

1.1.2 培養基及培養條件[6]種子培養基：含淀粉、糊精、蛋白胨、葡萄糖、黃豆餅粉、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO3和油，pH7.00。250 mL搖瓶裝種子培養基30 mL，28 ℃，200 r/min培養48～52 h。發酵培養基：含正丙醇、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、淀粉、糊精、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、葡萄糖和油，pH7.00。250 mL搖瓶裝發酵培養基30 mL，接種量10%，28 ℃，220 r/min培養7 d。

1.1.3 主要試劑及原料 玉米漿購自華北制藥康欣股份有限公司；(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、糊精、蛋白陳和葡萄糖等，均為分析純；紅霉素對照品，中國獸醫藥品監察所，批號:130307，含量:883 U/mg。

1.2 方法

1.2.1 發酵液化學效價檢測方法 硫酸水解法[7]，發酵液經離心后，根據確定好的倍數吸取一定量的濾液，用0.35%碳酸鉀液稀釋。然后，取稀釋液20 mL于分液漏斗中，加入醋酸丁醋20 mL，振搖30 min，放置分層，棄去下層水液，于丁醋液中加入無水硫酸鈉1g左右(可酌量多加使丁醋液澄清)，振蕩至透明。準確吸取其上層脫水液10 mL于另一干燥的分液漏斗中，精確加入鹽酸(0.1 mol/L)10 mL，振蕩30 min，放置分層，把下層鹽酸水液放入試管中，從中吸取5 mL放入另一試管中，加入硫酸(8 mol/L) 5 mL，搖勻，放入50 ℃水浴中，保溫30 min取出冷卻，于483 nm測定吸光度值，以紅霉素標準品繪制標準曲線，計算發酵液紅霉素的化學效價。

1.2.2 Plackett-Burman實驗設計 選取(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO3、淀粉、糊精、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、葡萄糖和正丙醇11個因素，應用Minitab 15進行Plackett-Burman設計，從而篩選出影響紅霉素效價的主要因素。

1.2.3 最陡爬坡實驗(steepest ascent design) 根據Plackett-Burman實驗結果中各顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向，以快速逼近最佳響應區域。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小確定，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。

1.2.4 響應面法(response surface methodology) 依據Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的實驗因素與水平，采用Box-Behnken實驗設計發酵培養基進行4因素3水平的響應面分析實驗。每個因素取三個水平，以(-1，0，1)編碼，根據相應的實驗表進行實驗后，對實驗數據進行方差分析及多元回歸分析，方差分析及回歸方程的顯著性檢驗采用F檢驗，以P<0.05判定為顯著。多元回歸模型擬合度采用R-Sq表示，以R-Sq>0. 9判定為優；擬合度失擬(Lack of Fit)以P>0. 05判定為失擬不顯著，說明回歸模型與數據擬合較好。最后在一定的水平范圍內求取各因素的最佳值。

2 結果與分析

2.1 紅霉素發酵效價主要氮源、碳源影響因子的確定 在前期單因素試驗的基礎上選用N=20的Placket-Burman實驗設計，對淀粉(A)、糊精(B)、玉米漿(C)、棉籽餅粉(D)、黃豆餅粉(E)、葡萄糖(F)、(NH4)2SO4(G)、MgSO4·7H2O(H)、CaCO3(J)、油(K)和正丙醇(L)11個因素進行了考察，每個因素取高(+)、低(-)兩水平，高水平約為低水平的1.25倍，響應值為紅霉素的效價(Y)，試驗設計及結果見表1，因素水平取值、效應及顯著性分析見表2。

表1 N=20的Plackett-Burman試驗設計及結果Tab 1 N = 20 Plackett-Burman experimental design and results

表2 Plackett-Burman試驗因素水平及其主效應分析Tab 2 Plackett-Burman test factor level and its main effect analysis

由表2可知淀粉、糊精、黃豆餅粉、玉米漿發酵液中紅霉素的效價有顯著性影響，其中糊精和黃豆餅粉影響極顯著。選出具有顯著性影響的4個因素做最陡爬坡試驗，這4個因素都有顯著負效應，因此在以后的實驗中應減少加量。

2.2 最陡爬坡實驗 接近最大響應面區域，響應面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實情形，要先逼近最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程。根據Plackett-Burman實驗結果，確定不顯著因素的水平，表現為正效應的因素取高水平，表現為負效應的因素取低水平。顯著因素的變化步長及方向的實驗設計及結果表明(表3)，第3組效價最高，因此以第3組的水平作為響應面實驗的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Tab 3 The steepest slope test design and results

2.3 Box-Behnken設計及分析結果 根據Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗得出淀粉52.0 g/L，糊精14.0 g/L，黃豆餅粉48.0 g/L，玉米漿15.0 g/L作為中心點，以紅霉素效價為響應值(Y)，利用Minitab 15響應面分析中的Box-Behnken設計，設計4因素3水平的實驗，各因素水平見表4，Box-Behnken實驗設計及結果見表5。通過對數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項式方程：

Y=-306806+5167.81A+6777.17B-352.250E+19088.6C-44.3984A2-310.375B2-16.1719E2-495.250C2+52.6250AB+21.5000AE-152.625AC-23.6250BE+17.0000BC+69.9375CE

表4 因素水平編碼表Tab 4 Factor level coding table

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Tab 5 Box-Behnken experimental design and results

通過Minitab 15軟件對試驗數據和模型進行分析，采用置信度為95% ，結果見表6。可以看出，該二次回歸模型極為顯著(P=0.000)，失擬項不顯著(P=0.1731)，說明模型與試驗擬合良好，可以用于紅霉素效價的分析和預測。方程的決定系數R-Sq=94.04%，說明模型可以解釋94.04%試驗所得發酵效價的變化，進一步說明該模型擬合程度良好。

依據回歸方程，利用Minitab 15軟件繪出響應曲面圖和等高線圖，結果見圖1和圖2。

表6 二次多項式的方差分析Tab 6 Variance analysis of quadratic polynomials

圖1 淀粉、糊精、黃豆餅粉和玉米漿對紅霉素效價交互影響的曲面圖Fig 1 Curve of interaction of starch, dextrin, soybean meal and corn steep liquor on erythromycin titers

圖2 淀粉、糊精、黃豆餅粉和玉米漿對紅霉素效價交互影響的等高線圖Fig 2 Contours of starch, dextrin, soybean meal and corn steep liquor on erythromycin titer interaction

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著[8]。淀粉-糊精的交互作用、淀粉-黃豆餅粉的交互作用、淀粉-玉米漿的交互作用以及黃豆餅粉-玉米漿的交互作用的等高線均呈橢圓形，表明淀粉-糊精、淀粉-黃豆餅粉、淀粉-玉米漿以及黃豆餅粉-玉米漿的交互作用均對紅霉素的效價有顯著性影響。利用Minitab 15軟件中的響應優化器對試驗模型進行分析，得到淀粉含量為52.3 g/L、糊精含量為14.0 g/L、黃豆餅粉含量為45.3 g/L和玉米漿含量為14.6 g/L時，紅霉素效價(Y)預測最大值為7734 U/mL。

2.4 響應面優化結果的驗證 根據最優化結果配制發酵培養基，分批次(3次)發酵，紅霉素發酵效價分別為7821、7709和7762 U/mL，均值7764 U/mL，與預測值7734 U/mL十分接近。同時，與原發酵培養基比較，紅霉素效價提高了12%。

3 討論與結論

在紅霉素的發酵生產中常采用的菌種為紅色糖多胞菌S.erythraea。1952年從具有不同抗生素活性的菌種中分離出S.erythraeaNRRL2338。起初該菌種的紅霉素產最僅為0.25～1.0 g/L。但在2005年有報道其產量已經達到10～13 g/L[9]。在紅霉素產量提升的過程中，菌種選育和發酵工藝優化起著重要角色。目前，傳統的紫外誘變、氯化鋰誘變、離子注入等方法仍被生產企業用來提高紅霉素產量[10-11]。工業生產菌株多為經過多次誘變后的高產菌株，但“誘變疲勞”效應使傳統誘變方法很難在提高產物產量方面再有較大突破。因此，代謝工程手段漸漸成為企業提高紅霉素產量的突破口，紅霉素發酵工藝優化已作為企業研究的重中之重。

紅霉素發酵培養基的主要成份為淀粉和黃豆餅粉[12]。在紅霉素工業生產中，降低原料成本是提高企業效益的有效手段，所以在國內出現了較多的采用廉價氮源替代昂貴氮源的報道。王曉磊等采用玉米粉水解物作為碳源在30噸發酵罐規模上使發酵單位提高了5.8%，綜合成本降低了26.0%[13]。張金國等采用廉價A粉和B粉替代淀粉、葡萄糖和黃豆餅粉后在10噸罐規模下產量提高了6.11%[14]。Zou等在初始培養基中添加玉米漿促進了菌體的前期生長，最終紅霉素效價提高了22.2%[15]。El-Enshasy等采用甘蔗糖蜜替代葡萄糖后結合補加正丙醇工藝使紅霉素產量提高了33.0%[16]。

研究采用響應面法對紅霉素發酵培養基中氮源和碳源進行了優化。首先，用Plackett-Burman試驗設計法選出了對紅霉素效價有顯著性影響的4個因素，分別是淀粉、糊精、玉米漿和黃豆餅粉；然后用最陡爬坡試驗逼近最佳響應面區域；最后通過Factors=4，Run=27的Box-Behnken設計進行優化，得出紅霉素最佳發酵培養基配方：淀粉52.3 g/L、糊精14.0 g/L、黃豆餅粉45.3 g/L、玉米漿14.6 g/L、(NH4)2SO48.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、CaCO35.4 g/L、棉籽餅粉 20.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、正丙醇 10.0 mL/L、油 20 mL/L，與華承偉等[6]做的優化結果基本一致。優化后的配方經過發酵之后測得紅霉素效價為7764 U/mL，比原配方提高了12%。

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