液相色譜-串聯質譜法測定阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼的研究

楊修鎮，陳 玲，尹伶靈，劉少寧，牛華星，張呈軍

(1.山東省獸藥質量檢驗所，山東省畜產品質量安全監測與風險評估重點實驗室，濟南 250022)

阿維菌素粉收載于《獸藥國家標準》(化學藥品、中藥卷)第一冊，為獸用殺蟲、殺螨劑，通過促進r-氨基丁酸(GABA)釋放，增強神經膜對CI-通透性，阻斷神經信號傳遞，使肌肉細胞失去收縮能力而致蟲體死亡，對寄生于動物體內的線蟲和節肢動物有極強的驅殺作用[1]。非潑羅尼(fipronil)是一種新型高效殺蟲劑，有觸殺、胃毒及內吸作用，對跳蚤、螨、鱗翅目、同翅目、半翅目等害蟲有效，但環境毒理學發現其對生態環境具有潛在的危險性[2]，我國于2009年10月起禁用于農業和畜牧業。2017年8月初，荷蘭爆出“毒雞蛋”事件，雞蛋受殺蟲劑非潑羅尼大范圍污染，持續發酵的歐洲“毒雞蛋”事件影響歐洲多國。阿維菌素粉是畜牧業臨床應用廣泛的驅蟲藥，部分養殖場夏季常用于防治蠅蛆，為防止不法廠家為增強阿維菌素粉的效果在其中添加非潑羅尼給畜禽產品帶來安全隱患，農業部緊急發布了2571號公告[3]，公布了獸藥中非法添加非潑羅尼檢查方法標準。該標準主要適用于阿維菌素粉，采用高效液相色譜法測定，紫外光譜匹配定性。目前尚無采用液相色譜-串聯質譜法測定阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼的報道。

1 儀器與材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯質譜儀；電子天平(感量0.01 g、 0.00001 g)；非潑羅尼對照品，批號20170328，含量98.5%，國家標準物質中心；阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件 色譜柱為C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相A：水；流動相B：乙腈；流速0.2 mL/min；進樣量2 μL；柱溫35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Tab 1 HPLC Gradient Elution

2.2 質譜條件 根據參考文獻[4]方法，電噴霧離子源；負離子掃描(ESI-)；多反應監測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：400 ℃；脫溶劑氮氣流速：900 L/h；毛細管電壓：3 kV；測試藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量經調諧確定，具體見表2。

表2 定性、定量離子對及對應的錐孔電壓和碰撞能量Tab 2 The qualitative and quantitative ion pair and the corresponding cone voltage and collision energy

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取非潑羅尼照品25 mg置25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1 mg/mL的非潑羅尼對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液，加20%乙腈水溶液逐級稀釋成5 ng/mL的非潑羅尼對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 稱取阿維菌素粉約1.0 g，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加乙腈約150 mL，振搖5 min，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 mL置100 mL容量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加20%乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.4 陽性樣品溶液制備 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，每1 g添加非潑羅尼10 mg后，按供試品溶液制備方法制備陽性樣品溶液。

2.4 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、陽性樣品溶液、陰性樣品溶液各2 μL，注入液相色譜-串聯質譜儀，在上述液相色譜條件和質譜條件下進行測定，陽性樣品溶液色譜中在與對照品色譜相應的位置出相同的峰，陰性樣品無干擾，結果見圖1～圖3。

圖1 非潑羅尼對照品溶液色譜圖Fig 1 Chromatographic trace of fipronil standard solution

圖2 陽性樣品溶液色譜圖Fig 2 Chromatographic trace of positive sample solution

圖3 陰性樣品溶液色譜圖Fig 3 Chromatographic trace of negative sample solution

2.5 線性關系考察 精密量取非潑羅尼對照品貯備液，用20%乙腈水溶液逐級稀釋成0.025、0.05、0.5、5、10、20 ng/mL的系列溶液，注入液相色譜-串聯質譜儀，在上述液相色譜條件和質譜條件下進行測定，以定量離子峰面積(y)為縱坐標，濃度為橫坐標(x，ng/mL)，進行線性回歸分析。回歸方程為：y=53349x-6170.7(r2=0.9995)，結果表明非潑羅尼進樣濃度在0.025～20 ng/mL范圍內與定量離子峰面積呈良好的線性關系。

2.6 基質效應試驗 精密量取非潑羅對照品貯備液，用陰性樣品溶液逐級稀釋成0.025、0.05、0.5、5、10、20 ng/mL的系列溶液，注入液相色譜-串聯質譜儀，在上述液相色譜條件和質譜條件下進行測定，與線性關系考察項相應濃度所得的色譜圖進行比較，相對偏差均小于3%，說明阿維菌素粉基質不會對非潑羅尼產生顯著的影響，故采用直接外標法定量。

2.7 檢出限與定量限 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，添加一定量非潑羅尼，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，在上述液相色譜條件和質譜條件下進行測定。滿足歐盟657號決議[5]規定的定性條件的最低添加量為本方法的檢出限，大于檢出限且定量離子色譜峰的信噪比(S/N)滿足在10∶1以上，并且回收率滿足80%～120%之間的最低添加量為本方法的定量限[6]。本方法的檢出限為0.04 mg/g，定量限為0.1 mg/g。

2.8 精密度與回收率試驗 取不含非潑羅尼的阿維菌素粉(批號20170301，山東天宇生物科技有限公司提供)，每1 g分別添加非潑羅尼0.1、1、30 mg(低量添加系采用加入一定量的對照品貯備液來實現，例如每1 g用移液器加入100 μL的1 mg/mL的非潑羅尼對照品貯備液來實現0.1 mg/g添加 )，各平行5份，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別注入液相色譜-串聯質譜儀，在上述液相色譜條件和質譜條件下進行測定，0.1、1、30 mg/g三個添加水平下，回收率在84.6%～112.6%之間，相對標準偏差為1.0%～7.7%。，結果見表3。

表3 精密度與回收率試驗Tab 3 Precision and recovery test

2.9 供試品溶液穩定性試驗 取同一陽性樣品溶液，于制備后0、2、4、6、12、24、48 h注入液相色譜-串聯質譜儀，在上述液相色譜條件和質譜條件下進行測定，非潑羅尼含量的RSD為4.2%，表明樣品溶液在48 h內穩定。

2.10 50批樣品檢測結果 對從獸藥GSP經營部隨機購買的50批阿維菌素粉按照本研究建立的方法進行檢測，結果均未檢出非潑羅尼。

3 討論與小結

目前家禽養殖場環境一般較差，糞便尚未完全做到無害化處理[7]，夏季蠅蛆滋生產生的傳染病嚴重影響了經濟效益。應將養殖場糞便及時清理，采用密封發酵處理等措施減少蠅蛆繁殖，而不是大量使用獸藥來控制蠅蛆。獸藥的大量使用除增加成本外，還會致使畜禽產品殘留量超標危害食品安全。

我國已發布的其他標準中，農產品中非潑羅尼的殘留檢測較為常見，例如SN/T 4039-2014出口食品中萘乙酰胺、吡草醚、乙蟲腈、氟蟲腈殘留量的測定方法液相色譜-質譜/質譜法，采用了乙腈提取、HLB固相萃取柱凈化的方法。阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼是以治療為目地的，添加量較大，因此，參照農業部公告第2571號公布的獸藥中非法添加非潑羅尼檢查方法采取了直接溶解稀釋法。

農業部公告第2571號公布的獸藥中非法添加非潑羅尼檢查方法采用紫外光譜匹配定性，物質的紫外吸收光譜是其分子中生色團及助色團的特征，而不是整個分子的特征，如果物質組成的變化不影響生色團和助色團，就不會顯著地影響其紫外吸收光譜[8]。本方法采用串聯質譜的兩對離子定性，大大排除了假陽性的可能，定性更為準確。非潑羅尼化學結構中含有-NH2等電負性較強的基團，易于失去H得到負離子峰，因此，采用負離子掃描(ESI-)模式。儀器在由正離子模式向負離子模式切換時應對系統進行足夠的平衡，少量甲酸的存在會嚴重影響離子化，必要時可對插入流動相的管線及吸頭先進行清洗。非潑羅尼極性較小，在色譜柱上保留較強，如果采用水-甲醇為流動相進行梯度洗脫，分析時間較長，乙腈洗脫能力強，黏度較小，可有效降低色譜系統壓力，且在實際分析中能夠獲得良好的峰形，故采用水-乙腈為流動相進行梯度洗脫。

阿維菌素粉基質較為簡單，基質效應試驗證明基質不會對非潑羅尼產生顯著的影響，因此，采用了直接外標定量的方法，且各添加濃度回收率能處于80%～120%之間，滿足定量要求。

從獸藥GSP經營部隨機購買的50批阿維菌素粉均未檢出非潑羅尼，這與農業部實施《獸醫獸藥經營質量管理規范》和以獸藥“二維碼”標識為核心的獸藥追溯監管工作有關。目前有些養殖場通過互聯網和物流渠道購買獸藥，獸藥管理部門難以對這種渠道的獸藥進行有效監管，應加大這種獸藥的檢查力度。

本試驗建立的阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼檢查方法簡便、準確、快速、靈敏，適用于阿維菌素粉中非法添加非潑羅尼的檢測。

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