FTIR法用于藥品微生物潔凈室環境菌庫的建立

周爽 錢文靜

[摘要] 目的 FTIR法用于藥品微生物潔凈室環境菌的研究，建立藥品微生物潔凈室環境菌FTIR光譜庫，以快速判斷藥品檢出菌是否為環境菌污染，為藥品無菌檢查一次檢出提供了準確性保證，同時對藥品微生物潔凈室實現動態監控。方法 用FTIR對潔凈室采集的環境菌進行光譜采集，選取特征區3 000～2 800，1 500～1 800，1 200～900 cm與指紋區3個典型分析譜區，并在此基礎上應用聚類分析。結果 利用FTIR獲得了分別率高、重現性好的紅外光譜圖，在基線校正和歸一化處理后的聚類分析結果，能使所有潔凈室采集的環境菌得到歸類，并建立本實驗室潔凈室環境菌庫。結論 FTIR法用于藥品微生物潔凈室環境菌庫的建立，具有簡單、快速、準確的特點。

[關鍵詞] FTIR；聚類分析；潔凈室；環境菌庫

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）01（a）-0125-03

藥品無菌檢查和微生物限度檢查必須在嚴格控制微生物污染的環境下進行，為了保證藥品質量安全，維持藥品潔凈實驗室操作環境的穩定性和檢測結果的可靠性，必須對藥品潔凈實驗室進行微生物監測和控制（2015版《中國藥典》四部9205），而藥品潔凈實驗室微生物的污染主要來源于操作者和物料。為了排除藥品無菌檢驗過程中假陽性的現象，應定期對藥品潔凈實驗室進行環境微生物的監測和控制并建立潔凈室環境菌庫，以此來判斷檢出菌與環境菌的關聯性，以排除實驗過程的污染。而微生物環境菌庫的建立方法不外呼用生化分析和分子生物學（如16SrDNA序列同源性）分析手段，但這些方法都耗時過長，且花費的成本過高，不適于藥品微生物快速檢驗的要求。近年來，傅立葉變換紅外光譜技術（FTIR）應用于微生物鑒別的報道越來越多，它能夠反映全細胞信息，甚至細胞核中蛋白質，多糖，核酸的分子振動情況，且它的分辨率高，重復性好[1]。該實驗室每周定期對潔凈室的浮游菌和沉降菌及表面微生物進行采集，應用FTIR技術對采集到的環境菌進行光譜掃描，通過聚類分析法確定其歸屬，建立本單位微生物潔凈室環境菌庫。

1 實驗材料

TENSOR-27-HTS-XT傅立葉紅外微生物測量系統（德國Bruker）；OPUS6.5分析軟件（德國Bruker公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；微生物FTIR圖譜測量專用的B-module附件，配有DTGS檢測器，ZnSe載樣窗片（德國Bruker公司）；電動接種環（德國Braun公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，青島高科園海博生物技術有限公司）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，青島高科園海博生物技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 潔凈室環境菌的采集

根據2015版《中國藥典》四部9205藥品潔凈實驗室微生物監測和控制指導原則要求，該實驗室采用胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）與沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）平皿定期對潔凈區不同部位的沉降菌和浮游菌及關鍵的檢測臺面、人員操作服表面及5指手套表面的微生物進行采集，采集方法按《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法》與《醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法》現行國家標準進行。表面微生物的采集方法按《中國藥典》四部9205要求進行。

2.2 實驗用各菌株的培養

將潔凈區采集到的環境菌分別置35℃和25℃培養3 d與5 d后，挑取細菌的單個菌落表面中心劃線于TSA平板上，于35℃培養24 h，準備FTIR掃描。標準菌株采用同樣的培養條件在相同的培養時間下培養，形成單菌落[2]。

2.3 FTIR測定樣品菌膜的制備和光譜采集

取上述相同培養條件的各菌種，用電動接種環挑取單個菌落表面中心，置于100 μL超純水中，制成均勻的菌懸液，隨后取15 μL于ZnSe載樣窗片上置于鼓風干燥箱中干燥15 min后待形成均一等厚的菌膜，進行FTIR測定。

將ZnSe載片置于B-module樣品倉中，進行FTIR測定，實驗參數為：波段4 000～600 cm，信號累加64次，光譜分辨率為4 cm，自動平滑處理。

2.4 環境菌FTIR光譜庫的建立和分析

應用OPUS6.5提供的定性軟件建立譜庫，依據Bruker的用戶手冊提供的方法，采用35℃培養（24±2）h的細菌，按單譜圖建立細菌菌庫。

對紅外光譜首先進行一階導數和矢量歸一化，選取900～1 200，2 800～3 000，1 500～1 800cm 3個典型的譜段進行判別。900～1200 cm為多糖類物質的典型吸收帶，2 800～3 000 cm為細胞膜上脂肪酸的特征吸收，而1 500～1 800 cm則是蛋白質酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的吸收。

3 實驗結果—環境菌傅里葉紅外圖譜的建立

每周定期從潔凈環境中采集的微生物（約2～4株），共采集12個月，挑選典型菌落，共106株菌進行純培養，采集FTIR圖譜，建立環境菌庫。在同樣的培養條件下，每株菌制作3張圖譜，剔除溢出光譜后取平均光譜，分別將近2個月，近半年以及一年菌株的紅外圖譜在特定譜段進行聚類分析，結果見圖1、圖2和圖3

將整個一年的環境菌紅外圖譜進行聚類分析，結果見圖4。

從上述圖可以看出，全年環境菌紅外圖譜差異較大，近兩個月各菌株紅外圖譜差異最小。

4 結論

因潔凈室的微生物污染主要來源于外環境，在短時間內潔凈區的污染微生物可能與外環境不同，但長期來說，潔凈室的微生物基本與外環境一致。通過對該單位潔凈室環境浮游菌和沉降菌進行的采集，建立一整年的環境菌FTIR菌庫，將近2個月的圖譜作為近期的環境菌庫，并定期進行調整，即不斷加入新的菌圖譜，剔除最初期的圖譜，使該菌庫能真實反映潔凈實驗室微生物污染的動態狀況，并為藥品檢出菌與環境菌相似性分析（藥品檢出菌是否為環境菌污染）提供簡便、快捷的分析方法，為藥品無菌檢查一次檢出提供了準確性保證。

5 討論

①微生物的紅外光譜技術靈敏度非常高，可以鑒別具有相近親緣關系的微生物，為了保證結果的可靠性，需要在標準化的條件下建立系統化的譜庫。培養基、培養溫度與培養時間及樣品預處理對紅外光譜都會產生影響，這些實驗條件應符合標準操作規程。

②樣品預處理過程中的非同源性、樣品量、菌膜的干燥程度以及測量因素都會影響紅外光譜圖。因此，需要對同一樣品進行多次測量，剔除溢出光譜，以確保紅外光譜圖的重現性。

③即使在標準條件下制備樣品，生物樣品的光譜仍會表現出一定的變異性。對同一樣品進行多次測量，剔除溢出光譜，計算得到的平均光譜來分析未知微生物，可以在相應的閾值內相比，準確性更高。

④藥品潔凈實驗室環境菌庫的建立是一個持續動態的過程，需要在日常工作中不斷持續的監測才能得以完善。

[參考文獻]

[1] 蔡飛，陸峰.傅里葉變換紅外光譜結合化學計量學在微生物判別、分類、鑒定中的應用[J].藥學實踐雜志，2002，20（4）：239-240.

[2] 裴琳，胡昌勤，馬仕洪，等.FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環境菌的相關性考察[J].藥學學報，2007， 42（11）：1189-1194.

（收稿日期：2017-10-15）