疫苗生產中豬源材料的外源性病毒檢測

杜巖 郝鵬博 謝秋紅 周長清 董思宏 楊蕾蕾 郭卉 任玉卓 劉志強

[摘要] 目的 加強水痘減毒活疫苗生產中豬源材料的外源性病毒的質量控制，防止外源病毒污染。方法 采用酶聯免疫法對人二倍體細胞2BS株及胰蛋白酶進行豬細小病毒檢測，并對檢驗方法進行方法學驗證。結果 人二倍體細胞2BS株及胰蛋白酶豬細小病毒檢測結果均為陰性，且方法學驗證中的精密度符合2010版《藥品GMP指南》的要求。結論酶聯免疫法準確、快速，可用于水痘減毒活疫苗生產中人二倍體細胞2BS株及胰蛋白酶的外源性病毒檢測。

[關鍵詞] 水痘減毒活疫苗；豬細小病毒；酶聯免疫法；豬源材料

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）03（a）-0140-02

Exogenous Detection of Porcine Materials in Vaccine Production

DU Yan， HAO Peng-bo， XIE Qiu-hong， ZHOU Chang-qing， DONG Si-hong， YANG Lei-lei， GUO Hui， REN Yu-zhuo， LIU Zhi-qiang

Quality Inspection Laboratory， Changchun Qijian Products Co.， Ltd.， Changchun， Jilin Province， 130000 China

[Abstract] Objective This paper tries to strengthen the quality control of exogenous virus of porcine source material in the production of live attenuated varicella vaccine to prevent the exogenous virus contamination. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect porcine parvovirus in human diploid cell line 2BS and trypsin. The test method was validated by methodology. Results Human diploid cell 2BS strains and trypsinized porcine parvovirus test results were negative， and the methodological validation of the precision in line with the 2010 version of “Drug GMP Guide” requirements. Conclusion Enzyme-linked immunosorbent assay is accurate and rapid and can be used to detect the exogenous virus of human diploid cell 2BS strain and trypsin in live attenuated varicella vaccine production.

[Key words] Live attenuated varicella vaccine； Porcine parvovirus； Enzyme-linked immunosorbent assay； Pig source material

如果在生產者建立細胞庫之前，細胞基質在建立或傳代歷史中使用了胰酶，則所建立的主細胞庫或工作細胞庫和（或）超過生產限定水平的細胞至少應檢測1次與胰酶來源動物相關的外源性病毒包括豬細小病毒[1]，在水痘減毒活疫苗生產過程中胰蛋白酶被廣泛應用于細胞培養的細胞分散階段[2]，故加強胰蛋白酶豬源病毒的檢測是十分必要的。該實驗采用酶聯免疫法（ELISA），對該公司用于生產的工作細胞庫、生產用對照細胞、超過生產限定水平的細胞及胰蛋白酶1行豬細小病毒檢測，并對此檢驗方法進行方法學驗證[3]，先將檢測結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

EON酶標儀，MK3酶標儀。

1.2 試劑與供試品

①豬細小病毒酶聯免疫分析試劑盒。②人二倍體細胞2BS株（工作細胞庫批號：2015127、生產用對照細胞批號：37代2015-25-1～6超過生產限定水平的細胞批號：38代2015-25-1～6）。③胰蛋白酶廠家Gibco批號：1629354、1664248，美國BD批號：4028465。④胰蛋白酶：精密稱取0.25 g，用PBS稀釋成濃度為0.25%的樣品溶液。⑤人二倍體細胞2BS株：用PBS稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/mL左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20 min（2 000～3 000 r/min）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

1.3 方法

1.3.1重復性 在同一實驗室，由同一分析人員對供試品按試劑盒說明書進行試驗，檢驗3批供試品，每批檢驗6次。

1.3.2 中間精密度 在同一實驗室，不同時間由不同分析人員用不同設備取同3批供試品按試劑盒說明書進行試驗，每批檢驗6次。

2 結果

2.1 重復性

胰蛋白酶及人二倍體細胞2BS株各三批，每批檢驗六次，陰性對照、陽性對照均成立，供試品結果均為陰性，試驗表明該方法重復性好，穩定可靠。見表1、表2。

2.2 中間精密度

不同時間由不同分析人員使用不同設備（酶標儀）取胰蛋白酶三批，人二倍體細胞2BS株三批分別按試劑盒說明書檢驗，每批樣品檢驗3次，陰性對照、陽性對照均成立，供試品結果均為陰性，試驗表明該方法中間精密度好，受隨機變動因素影響較小。見表3、表4。

3 結論

目前國內除無菌試驗方法驗證有法定的標準要求，其他定性方法并沒有相關法定標準，在疫苗生產中，豬源材料來源于動物，對疫苗的安全性有較重要的影響，故加強豬源材料的質量控制是十分必要的。

該文參考2010版《藥品GMP指南》對豬細小病毒檢測進行方法學驗證， 通過方法學驗證證明酶聯免疫法準確、快速，可用于人二倍體細胞2BS株及胰蛋白酶的豬細小病毒檢測。水痘減毒活疫苗所采用的人二倍體細胞2BS株及胰蛋白酶通過該實驗已證明無豬細小病毒污染，安全可靠，可用于水痘減毒活疫苗生產。

2015版《中國藥典》新增對細胞基質在建立或傳代歷史中使用了胰酶，應檢測與胰酶來源相關的外源病毒，通過該實驗保證了該公司生產的水痘減毒活疫苗的安全性，下一步考慮增加其他相關豬源病毒檢測。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典.三部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：19-21.

[2] 趙凱，章以浩，李和民.醫學生物制品學[M].2版.北京：人民衛生出版社，2007：163-165.

[3] 國家食品藥品監督管理局藥品認證管理中心編.藥品GMP指南[S].北京：中國醫藥科技出版社.

（收稿日期：2017-12-10）