細菌產(chǎn)生的纖維素酶（綜述）

嚴鴻林

摘 要：纖維素是地球上一種豐富的天然生物聚合物和主要的農(nóng)業(yè)廢棄物。這種纖維素生物質(zhì)是一種具有被生物轉(zhuǎn)化為增值生物產(chǎn)品巨大潛力的豐富的可再生資源。它可以被纖維素分解菌產(chǎn)生的纖維素酶降解。這種酶有多種工業(yè)用途，目前被認為是最重要的工業(yè)酶。本綜述將探討纖維素酶的應(yīng)用、分類和定量以及纖維素分解菌的類型和篩選，也將介紹通過液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)纖維素酶、纖維素酶的性質(zhì)以及纖維素酶基因的克隆和表達的最新知識。此外，本文還將討論研究纖維素酶的生物技術(shù)及其未來展望。

關(guān)鍵詞：纖維素分解菌；生物轉(zhuǎn)化；纖維素酶；內(nèi)切葡聚糖酶；外切葡聚糖酶；β-葡萄糖苷酶；纖維小體

中圖分類號：S8516 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）09-0051-04

地球每年大約產(chǎn)生2 000億t CO2，這意味著有相同數(shù)量的有機物被降解，其中30%被動植物利用而其他的70%被微生物降解。一般來說，纖維素約占植物生物質(zhì)干重的50%。這些植物生物質(zhì)是可供人類使用的燃料和材料的唯一可預(yù)見的可持續(xù)來源。農(nóng)業(yè)廢棄物是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的主要來源，木質(zhì)纖維素具有可再生、未開發(fā)且廉價的特點。這些可再生資源來自玉米皮、玉米秸稈、甘蔗渣、稻草、稻殼、木本作物、森林殘留物的葉子、莖和秸稈。除此之外，它們還來自工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素廢棄物，如柑橘皮、椰子生物質(zhì)、木屑、紙漿、工業(yè)廢料、城市纖維固體廢物和造紙廠污泥。此外，它們還可來自生物燃料專用能源作物，包括多年生牧草（如柳枝稷）和其他牧草飼料（如芒草、大象草、百慕達草等）。

大約70%的植物生物質(zhì)被鎖定在5-碳糖和6-碳糖中。這些糖存在于木質(zhì)纖維生物質(zhì)中，木質(zhì)纖維生物質(zhì)主要由可被一種復(fù)雜的酶系統(tǒng)即纖維素酶（外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等）水解的木質(zhì)素（由β-1，4糖苷鍵鏈接的葡萄糖同源聚合物）、少量的半纖維素（由戊糖D-木糖、達拉定糖和己糖D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖與糖酸組成的5-和6-碳糖的異源聚合物）和極少量的木質(zhì)素（一種復(fù)雜的芳香族聚合物）組成。在硬木中，半纖維素主要為木聚糖；而在軟木中，半纖維素主要是葡甘露聚糖。簡單來說，木聚糖降解需要內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶以及乙酰木聚糖酯酶。葡甘露聚糖的降解需要β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶切割其聚合物骨架。

有限的天然化石燃料儲備正在以驚人的速度被文明世界消耗。燃燒化石燃料也引起了對不穩(wěn)定且不確定石油資源、燃料成本上漲以及全球氣候變暖的擔(dān)憂。這些擔(dān)憂已經(jīng)轉(zhuǎn)向到利用可再生資源來生產(chǎn)能夠滿足世界高能需求的“更加綠色的”能源替代品。到2010年，加拿大可再生能源燃料標準提高到乙醇含量5%的混合燃料；2009年美國環(huán)保局將其可再生燃料標準提高到乙醇含量10.21%的混合燃料；而巴西的混合燃料的標準是含25%的乙醇（2007年確立）。纖維素酶占全球工業(yè)酶需求量的8%。當(dāng)纖維素酶用于將預(yù)處理的纖維素類物質(zhì)水解成糖（所產(chǎn)糖可以大規(guī)模發(fā)酵成生物乙醇和生物堿產(chǎn)品）時，纖維素酶市場將大幅擴張。據(jù)估計，美國的纖維素酶市場每年高達4億美元。在2004-2014年期間，作為一種特殊的酶，纖維素酶的使用量預(yù)計將增加一倍。生物技術(shù)公司Genencor國際公司和Novozymes公司報道，他們已經(jīng)開發(fā)了可以降低纖維素至乙醇轉(zhuǎn)化工藝中所用纖維素酶成本的技術(shù)，使每加侖乙醇的生產(chǎn)成本從5.4美元降低至20美分左右，其中兩個重要策略是：（1）控制纖維素酶的生產(chǎn)成本，通過優(yōu)化加工工藝和增強菌株產(chǎn)酶能力來降低每千克酶的生產(chǎn)成本，例如：從乳糖到葡萄糖選用更廉價的培養(yǎng)基和新的誘導(dǎo)系統(tǒng)； （2）提高纖維素酶的性能以在減少酶使用量的同時能獲得與酶混合物相同的水解能力，同時改善酶產(chǎn)品的組成。

除此之外，纖維素酶在工業(yè)上的主要應(yīng)用是紡織工業(yè)中織物的生物拋光和生產(chǎn)砂洗外觀的牛仔布以及用于增加衣物柔軟度和亮度的家用洗滌劑。另外，它們還應(yīng)用于動物飼料中以提高養(yǎng)分消化率和質(zhì)量，以及用來制作果汁和烘焙食品，而紙張脫墨是另一個新興的用途。纖維素酶有可能發(fā)揮重要作用的一個挑戰(zhàn)性領(lǐng)域是將可再生的纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為商用化學(xué)品的生物轉(zhuǎn)化。酶在清潔劑、皮革和造紙工業(yè)中的應(yīng)用需要能夠在極端pH和溫度條件下具有高穩(wěn)定活性。纖維素酶和纖維素分解菌的一些重要用途列于表1中。

本篇綜述將闡述在自然以及人工技術(shù)條件下纖維素酶的生產(chǎn)。此外，本文將從綜合視角以及纖維素分解菌和酶系統(tǒng)多樣性的角度描述細菌性纖維素酶的應(yīng)用，并將力圖討論纖維素酶在細菌系統(tǒng)中的作用方式和它們的分子生物調(diào)節(jié)作用。此外，本文還將探討異源宿主中纖維素酶基因的克隆和表達、以及這些罕見的纖維素酶如何幫助人們解決生物燃料工業(yè)的一些重要技術(shù)瓶頸和生物技術(shù)中一些獨特的細菌策略如何幫助生物煉制。

1 纖維素酶的分類

微生物產(chǎn)生的纖維素酶以游離或與細胞結(jié)合的方式水解和代謝不可溶性纖維素。在過去30年中，人們已經(jīng)對需氧、厭氧細菌及真菌產(chǎn)生的纖維素酶系統(tǒng)的生物化學(xué)分析技術(shù)進行了全面的綜述。以下的纖維素酶系統(tǒng)是根據(jù)其催化作用模式進行分類的（表2）。

1.1 內(nèi)切葡聚糖酶或內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖水解酶（EC 3.2.1.4）

內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素多糖鏈中的內(nèi)部無定形位點隨機切割，產(chǎn)生各種長度的寡糖以及新的鏈末端。它通常作用于酸膨脹的無定形纖維素、纖維素的可溶性衍生物如羧甲基纖維素和纖維低聚糖等底物。

1.2 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶（纖維二糖水解酶）（EC 3.2.1.91）

外切葡聚糖酶以強占的方式作用于纖維素多糖鏈的還原性或非還原性末端，產(chǎn)生兩個重要的產(chǎn)物葡萄糖（葡萄糖水解酶）和纖維二糖（纖維二糖水解酶）。這些酶對結(jié)晶底物如微晶纖維素、無定形纖維素和纖維寡糖具有活性。然而，它們對纖維二糖或可溶性纖維素衍生物如羧甲基纖維素?zé)o活性。

1.3 外切葡聚糖酶或1，4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶（也稱為纖維糊精酶）（EC 3.2.1.74）

它能夠催化除去纖維寡糖或硝基苯基-β-纖維二糖苷中的纖維二糖，但對無定形纖維素或羧甲基纖維素?zé)o活性。

1.4 β-葡糖苷酶或β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶（EC 3.2.1.21）

β-葡糖苷酶可從非還原端將可溶性纖維糊精和纖維二糖水解成葡萄糖。它對結(jié)晶或無定形纖維素?zé)o活性。

1.5 纖維二糖磷酸化酶或纖維二糖：正磷酸α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.20）

它能夠催化纖維二糖的可逆磷酸裂解部。該酶最初由Ayers等在紅球菌（Ruminococcus albus）的細胞中發(fā)現(xiàn)。

纖維二糖 + H3PO4 = α-D-葡萄糖 1-磷酸 + 葡萄糖

1.6 纖維糊精磷酸化酶或1，4-β-D-寡葡聚糖正磷酸鹽α-D-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.49）

它在熱感染梭菌細胞中被人們發(fā)現(xiàn)，對纖維二糖不起作用，但可催化纖維糊精從纖維三糖到纖維六糖的可逆磷酸化裂解。

（1，4-β-D-葡糖基）n + H3PO4 = （1，4-β-D-葡糖基）n-1 +α-D-葡萄糖-1-磷酸

1.7 纖維二糖差向異構(gòu)酶（EC 5.1.3.11）

它最初在紅球菌的細胞中被人們發(fā)現(xiàn)，催化下列反應(yīng)：

纖維二糖 = 4-O-β-D-葡萄糖基甘露糖

2 篩選產(chǎn)生纖維素酶的細菌

通常在含有結(jié)晶纖維素或微晶纖維素（如微晶纖維素）[瓊脂中的最終濃度為0.1%～0.5%（w/v）]的平板上篩選有細菌性纖維素酶活性的微生物分離株。在經(jīng)過一段合適時期的孵育后，若菌落周圍出現(xiàn)一個清除的區(qū)域，表明這是纖維素生產(chǎn)者。然而，能分解纖維素的噬細胞菌屬細菌不會出現(xiàn)任何的清除區(qū)域。因此清除區(qū)域的直徑可能無法精確反映此細菌真實的纖維素酶活性。

為快速篩選可以產(chǎn)生纖維素酶的細菌，在用含0.5%（w/v）的羧甲基纖維素為唯一碳源的瓊脂培養(yǎng)基孵育后，用1%（w/v）剛果紅浸泡；20 min后倒出該染料，該平板再用 5 M的NaCl溶液浸泡，20 min～30 min后倒出NaCl溶液。在紅色背景上，被一個淺橙色至透明的區(qū)域包圍的菌落即是可產(chǎn)生纖維素酶的陽性細菌。此纖維素分解菌可用此類平板直接篩選出，但要分離出活性菌落，利用總平板的復(fù)制平板培養(yǎng)法更適合，因為浸泡的試劑會傷害分離株。Plant等報道了將天青色纖維素加入瓊脂管上面兩層來分析細菌的纖維素酶活性的半定量測定法。底物中釋放的染料可以用光密度法測定。Kasana等（2008）發(fā)現(xiàn)，用革蘭氏碘替代十六烷基三甲基溴化銨或剛果紅染色平板，能快速得到高辨識度的結(jié)果。

然而，利用染料進行的平板篩選法并不是一種定量方法，因為酶活性與光暈大小之間的相關(guān)性較差。這個問題可通過開發(fā)一類含有經(jīng)過修飾的還原末端和發(fā)色/熒光基團（如熒光素、試鹵靈和4-甲基傘形酮）的短纖維寡糖來解決，以獲得更高的靈敏度和定量。但是，將熒光底物用于瓊脂平板的一個主要限制是其水解產(chǎn)物往往會大量擴散，因此使用這樣的化合物仍然存在困難。因此，在平板法中，人們會合成新的底物——2-（2'-苯并噻唑基）-苯基[2-（2'-benzothiazolyl）-phenyl，BTP]纖維寡糖來篩選纖維素分解菌。

現(xiàn)在，研究人員已經(jīng)將重點放在極端環(huán)境中不可培養(yǎng)的微生物的纖維素酶基因上，因為它們對惡劣環(huán)境條件有較高的抵抗力，希望能分離到的酶是新的且在生物煉制工業(yè)中具有特殊的用途。為了快速鑒定從可培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的所有細菌中分離到的新的纖維素酶，我們應(yīng)該建立宏基因組克隆庫，然后進行功能篩選。

（待續(xù)）