養殖過程中的生物安全

莊志偉 薛墨庸 韓薇 秦玉昌

摘 要：實驗室檢測，一是涉及食品安全問題（如病毒、細菌和寄生蟲）的檢測診斷與分析以及重金屬的檢測等，二是血清學檢測，主要是指抗體檢測，在保證合理采樣與正確運輸的基礎上，采用規范的實驗操作來減少相關的誤差，確保實驗結果的準確性與及時性。針對臨床疾病的復雜程度，正確的實驗室檢測是提供合理的診斷與防控措施的依據之一，也是生物安全體系不可或缺的重要部分。

關鍵詞：養殖；生物安全；檢測；防控

中圖分類號：S851 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）09-0055-06

隨著中國改革開放程度和人們對動物疾病對人類健康危害的認識程度逐步提高，規模化養殖場的硬件設施和養殖者的管理水平也在不斷提高。但是，由于眾多的原因，疫情反而越來越復雜，臨床疾病主要是全身性感染疾病、呼吸道疾病和消化道疾病，這主要是因為毒株的變異增加了疫病的復雜性，尤其病原的隱性感染和種畜禽的隱性帶毒導致了病原的不明傳播。另外，已得到控制的疫病再次暴發，使防控越來越難，疾病已經成為制約養殖生產的重要因素之一。養殖從業者已經清晰地意識到僅靠生產數據、臨床癥狀、病理變化及飼養管理調整來進行疾病診斷較為困難，因此需要借助實驗室檢測結果和各種疾病的流行病學來共同確診，實驗室檢測已經成為生物安全體系不可或缺的重要部分，也是獸醫的“第三只”眼睛[1]。5S管理由于能在短期內改善生產環境并提高生產效率已被廣泛應用，“實驗室檢測”實時反映公眾的關注點，也使公眾的注意力可視化，有能力驗證實驗做得規范且結果準確才是實驗室能力的綜合體現。

1 檢測功能

可據不同目標來制定相應的檢測方案。

1.1 確定首免時間

每2周采樣檢測母源抗體衰減規律，準確把握首免時間，根據本場情況決定第二次免疫時間是間隔2～3周還是4～5周。應急時根據本場具體發病時間，結合疾病的潛伏期再前推1周來確定免疫時間。

1.2 流行病學的調查

可以通過檢測疾病發生或流行擴大情況，結合季節變化和區域情況預測可能會發生的疾病。流行病學調查作為實驗室檢測診斷的基礎之一，具有深遠的防控指導意義。

1.3 引種檢測

可采取病原、抗體檢測，二者結合使用效果最好，檢測被引種場的帶毒情況及其抗體水平，家禽至少按照每批30羽份采樣，而豬則要全采樣。可合并樣本來加速檢測，如出現異常問題再按照合并前的樣本對每份進行檢測，但需全部檢測不能漏檢。

1.4 調整免疫程序

在結合重大防控計劃、本場既往發病史、生產性能情況以及周圍疫病流行情況制定免疫種類的基礎上，通過病原檢測與抗體檢測相結合來分析與發現問題，選擇免疫效果好的疫苗，規范免疫途徑和方法，同時重視細胞免疫和全身免疫的協調配合來合理制定免疫程序，注意考慮季節性免疫及疫苗間的相互干擾和不同免疫方法產生不同免疫力。

1.5 根據藥敏試驗結果用藥

根據藥敏試驗選擇用藥，以快速恢復動物機體的健康，減少盲目用藥和降低生產成本。對耐藥的菌株進行研究，剔除耐藥基因恢復藥敏性，還要注意培養基中含有的二價離子對氨基糖苷類藥敏結果造成的誤差，注意用藥方法與途徑[2]。

1.6 準確診斷

充分考慮發病群體的數量以確定合理的采樣數量和正確的采樣部位，還要確保正確的運輸方式以保證樣本的新鮮度，再加上實驗室的良好操作規范，并結合流行病學和臨床生產才能做出準確診斷。不能檢測出什么病原就認為是它引起的正在發生的疾病，以防止誤導生產企業，這樣才能建立起良好的互信機制。

1.7 有效治療

在準確診斷的基礎上，通過病理分析了解是原發性疾病還是繼發性疾病，結合飼養管理的改善來制定合理的綜合防治措施，使之行之有效。

1.8 動保產品的評估

一定要結合臨床表現和實驗室檢測進行評估。可以為養殖場選擇產品和藥物使用劑量提出合理的參考，從而減少異源毒的危害、降低使用成本以及提高食品安全。

1.9 動保產品研發

分離優勢毒株進行免疫原性和細胞適應性的研究，選擇適合開發疫苗的毒株，并申報相關課題以進行進一步的研究，為成果轉化做好充分的準備。

2 樣本的采集

2.1 疫苗樣本

采集樣本時機應恰當，因多數弱毒疫苗不帶有標記基因，病原檢測無法區分疫苗毒和野毒，禽用疫苗相對容易區分，而豬用疫苗要在采樣時避開疫苗排毒時間（表1）。

2.2 抗體樣本

家禽的樣本數量一般每棟30個樣本即可，豬抗體檢測以仔豬不少于15頭、母豬30頭、公豬100%的標準采樣（表2）。

2.3 病料采集

可以根據疾病流行病學來初步判斷采樣器官的范圍，結合臨床不同的發病時間采集不同的靶器官樣本。由于家禽解剖結構特殊，其采樣相對簡單，如肝、脾、腎和肺；而豬的不同病原在不同時間作用的靶器官不同，具體詳見表3；據發病群體的數量決定檢測比例，每棟（舍）10頭以上病死豬，每單元5頭以上病死豬，按照公豬100%、母豬5%、仔豬2%的比例進行檢測；必須重視免疫群體的健康狀況及應答能力。

3 樣本運輸與處理

3.1 標記

做好標記，如聯系人、品種、日齡、時間、地點等。

3.2 保存與運輸

樣本立即進入實驗室保存的，則放置于 4 ℃；若需要運輸應先經-20 ℃冷凍后盡快送到實驗室。運輸時要加足冰塊，6面加冰固定包裝，以在到達實驗室時仍有冰塊未全部融化為準，不同的季節要用不同數量的冰塊。

3.3 預處理

在接到樣本后對其進行預處理：血液樣本要在運輸前進行離心取血清，冷凍運輸。到達后要進行預化凍，盡快進行，不能反復凍融。組織樣本可加PBS液研磨后取上清液，糞便樣本離心取上清液。

3.4 流行病學調查

檢測前關鍵是要進行流行病學調查，不能盲目取樣，初步確定可能發病情況和范圍，結合引種、周圍疫情、臨床表現和病理剖解進行綜合判斷，為實驗室檢測的大方向奠定基礎。

3.5 檢測方法

如果檢測劑量少，可用RT-PCR方法檢測，可以使用不同的引物進行多種病原檢測，此方法敏感性高但易出現假陽性。要按照國際標準或國內標準執行，規范操作，不能污染樣本。需要結合抗體檢測時，可使用相應的商品化抗體檢測試劑盒進行[3]。

4 誤區與不足

4.1 首免時間憑經驗確定

不同品種的豬或雞由于疫苗種類、動物健康情況和產房管理的不同，免疫程序不同，因此其后代的首免時間也不一樣。

4.2 引種檢測只關心抗體

引種時關心抗體檢測水平，對病原檢測不重視。必要時需要到引種場采樣檢測或實地考察。

4.3 免疫程序千篇一律

免疫程序要結合重大疾病防控計劃、周圍疫情、本場發病史和本批次的檢測情況進行合理的調整。

4.4 確診依據片面

在疾病檢測診斷上，普遍存在檢測到什么病原就認為正在發生什么疾病，不結合當前的流行病學和臨床情況，造成檢測結果誤判而誤導生產。

4.5 防治措施不全

防治措施只根據檢測結果執行，沒有改善飼養管理，導致效果明顯下降，造成養殖場對檢測結果產生懷疑。

4.6 實驗室信息提供單一

實驗室往往停留在為養殖場提供檢測結果，具體措施比較粗糙，停留在表面上。應加強有效的獸醫分析和實驗數據的應用，以上升到生產獸醫或更高層次的獸醫角度來思考分析問題，提出綜合措施。

4.7 檢測目標缺乏針對性

實驗室在檢測樣本時往往對所有疾病都進行檢測，這既浪費時間又增加成本。在采集樣本時要結合流行病學，劃定可能發病的范圍和發病的時期，以決定不同的采樣器官，這樣采集的樣本才有代表性，檢測才能既快速又準確。

4.8 樣本數量設定不科學

采樣數量不能出于省錢的目的而人為減少，要科學設定置信區間。不同的置信區間與群體數量對采集的樣本數有不同的要求。

4.9 樣本保存不當

樣本運輸時常是密閉不保溫，外包裝太薄，冰塊又不是按樣本四周進行環繞固定，往往到實驗室時因為腐敗或融化而檢測不到病原，耽誤診斷與生產。

4.10檢測不規范

檢測不按規范程序進行，隨心所欲的情況時有發生。檢測結果時有電泳不清或拖尾，或者結果出現多種條帶使人產生懷疑，也給許多人找到疾病復雜不好防治的借口。

4.11 采樣時缺乏了解用藥情況

檢測細菌樣本在采集時不問是否用過藥物而盲目采樣，導致無法檢測到病原菌，錯過最佳治療時機。

4.12 診斷結果不科學

檢測到疾病病原多就盲目判定是病毒繼發，而沒有根據病理變化確認哪個是原發性疾病哪個是繼發性疾病。

4.13 實驗室服務有待提升

實驗室檢測服務太局限，要向前延伸到制定與實施合理的采樣和防控方案，向豬場的健康顧問發展。

4.14 現場執行能力有待提高

檢測結果準確、措施到位而治療效果不佳的問題時常出現，要學會現場指導與改善，往往現場把許多習以為常而不對的作為正確的事來做，另一個是執行力問題。

4.15 藥敏試驗

進行藥敏試驗時對培養基離子價數、pH不關注，而鎂離子會影響強力霉素的抑菌作用，pH會影響紅霉素的藥效等。藥敏結果相差很大，易造成誤導用藥。

4.16 設備維護

自動設備應用系統間的誤差和儀器比對校正問題要重視，這會直接影響結果，因此要定期請有資質的質檢部門校準或矯正。

4.17 員工素質低

員工對質控的認識程度不足，對儀器高度依賴，缺乏綜合分析的能力，出錯的概率很大。操作時應以檢測值為中心，減少檢測前與檢測后的誤差，確保實驗室整體檢測質量水平。

4.18 檢測目標的判斷

分清是需檢測血清還是血漿，血清是指血液凝固后未經稀釋的細胞外成分，血漿則是指加抗凝血劑后血液經離心的上清液，要長期關注檢測分析相關的質量控制。

4.19 實驗室的作用認識不清

出現問題時經常把實驗室作為“救火隊員”，解決不了就說解決問題的意義不大，不加強日常檢測計劃，而是有病亂求醫。

5 討論

（1）畜禽疾病檢測機構存在許多不足，如只進行ELISA、PCR和細胞檢測而未進行病理檢測，導致不能準確診斷；另外，檢測費用高，尤其對豬樣本的檢測，限制了檢測項目的推廣，也缺乏生產獸醫能把臨床和生產實際結合進行有效分析和應用的實驗大數據。

（2）實驗室檢測包括病原微生物診斷分析（病毒、細菌以及寄生蟲檢測）和血清學檢測（主要是抗體檢測）。病原微生物檢測用于引種、生物安全監控、養殖場疫病診斷與凈化或可能的風險預警，可以實時掌握養殖場病原微生物的感染狀態，對維持畜禽健康和降低發病的風險或疾病預警都具有重要的意義，“實驗室檢測”反映了公眾的關心，這是當今公眾熱衷的一個指標。對于目前的養殖現狀，我們能在發病時快速而準確地診斷出病原，并為相關的解決方案提出提供重要的依據?？贵w檢測是檢測機體對病原產生的特異性抗體，主要用于根據抗體水平來評估疫苗的免疫效果和發病前后抗體變化，以證明我們在診斷疾病時是否存在漏洞，又可了解母源抗體的衰減規律，為合理制定首免時間提供重要依據，抗體檢測原則上不要檢測太多。實驗室檢測作為輔助工具，要有生產獸醫或更高層次的保健或管理獸醫對檢測數據進行合理的分析，并充分結合臨床表現和流行病學，提出切實可操作的防治方案。

（3）檢驗數據與臨床癥狀不符時，實驗室應立即檢視品管控制，重復檢測，并注意反思和重新審核是否存在人為疏失。若真有錯誤，應立即更正并誠心道歉；若數據確實正確無誤，送檢單位也應與實驗室共同探討原因或是否重新送檢。從采樣到檢測再到出報告需要經過許多環節，單純的檢驗部分只占一個小環節，真正出錯的原因多是人為疏失和對樣本處置不當造成的，還有是其他物質如藥物產生的干擾。要重視樣本溶血現象，如采血時出血緩慢，卻使用過大的拉力抽?。谎河舍樛泊蛉朐嚬軙r，未先將針頭拔下；抗凝劑過多而血液過少；血液與抗凝劑混合時，搖蕩過猛或過久；未先將血清（漿）與血球分離，即放入冰箱冷凍；放置過久的血液，特別是有添加抗凝劑等因素。

（4）針對實驗室檢測樣本數量不足問題，重點是病料物流運輸條件受限制和養殖場因怕影響經營與撲殺而不愿將疫情公開化，解決這一問題的辦法是由農業部或行業聯盟牽頭，實行結果實時上傳和信息共享，承擔起區域動物疾病流行病學調查的職責；再利用物聯網技術建立起可視化的遠程診斷系統，充分利用真正的專家和實踐經驗豐富的一線人員之間的思想碰撞優勢，形成及時有效的防治措施。國家或聯盟（協會）可以利用實時上傳的數據進行大數據分析，共享信息平臺，建立起適合局部乃至全國的疾病發病模型來預測疾病發生的機制，也就是所謂的管理獸醫職能的體現，形成全國一盤棋。

參考文獻：

[1] 李艷，李山.臨床實驗室管理學（第3版）[M].北京，人民衛生出版社，2012：26-28.

[2] 劉玉慶，等譯.歐盟藥敏檢驗標準[M].北京，中國標準出版社，2016：9-11.

[3] 劉玉慶，等譯.細菌抗藥性原著（第2版）[M].北京，化學工業出版社，2012：133-136.