植物組織培養中污染防控方法研究

張朕 馬艷麗

摘 要：植物組織培養在植物轉基因技術實施、植物繁殖、新品種培育中具有重要意義，但植物組織培養中極易發生植物材料污染，致使科研和生產無法進行，運行成本增加。本文通過近年的大量實驗，分析了植物組織培養污染發生原因，并總結了較好的防控污染方法。

關鍵詞：植物；組織培養；污染防控

文章編號：1004-7026（2018）01-0066-02 中國圖書分類號：Q943.1 文獻標志碼：A

植物組織培養是20世紀初以植物生理學為基礎發展起來的一門新興技術，這項技術已在科研和生產中得到廣泛應用，經過多年發展研究技術已相對成熟。但是在組培過程中仍易發生污染，致使科研和生產成本增加。項目組成員在多次組織培養實驗中，總結出如下組織培養污染防控方法。

1 組培環境無菌防控

在進行組織培養之前，首先要建立組培實驗室。實驗室包括準備室、無菌操作室（接種室）和培養室。植物組織培養是一種要求做到無菌操作和無菌培養的技術，這種技術有兩個個主要目的：一是防止實驗室的培養物被外來微生物，如皮膚、衣服或周圍環境中的微生物污染；二是防止實驗工作者被微生物感染。組培環境中造成污染影響的因素主要是室內空氣中漂浮的細菌和真菌孢子，因此我們在實驗之前都會對接種環境和培養環境進行滅菌處理。包括每次接種前都要用紫外線滅菌燈對接種環境和無菌操作臺進行15分鐘照射，并用75%酒精擦拭無菌操作臺和接種人雙手；接種時一旁點燃酒精燈，并使玻璃罩門開到僅夠實驗人員伸入雙手接種程度即可。

2 外植體消毒

外植體因生長環境的原因，使其表面會帶有細菌，同時外植體的內生細菌也會造成組織培養的污染，為此，適宜采取以下防控措施：

2.1 外植體表面消毒處理

將外植體先用洗衣粉或者肥皂水浸泡30分鐘，然后用清水清洗。將外植體移至無菌室用75%酒精浸泡10～15s，用無菌水沖洗2～3遍，再用0.1%升汞浸泡10min，倒出后用無菌水沖洗3遍，才可以進行接種。

2.2 外植體內生細菌的殺菌處理

2.2.1 多次消毒（滅菌）。先用飽和香皂水對外植體浸泡20～30min，再用0.1%高錳酸鉀溶液處理5min，然后用4%次氯酸鈉加0.1%升汞消毒，最后用500mg/L先鋒霉素或羧芐青霉素的無菌水洗，都取得了理想的消毒效果，可使污染率降低50%[1]。

2.2.2 使用混合的消毒液消毒。對于乳汁等分泌物較多的外植體用含聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸、抗壞血酸、多菌靈、氨芐青霉素或氯霉素的混合液預處理，既可減少酚和乳汁的分泌，也減少了污染。

3 操作過程中污染防控措施

3.1 實驗器材滅菌

實驗器材包括各種玻璃材質的培養器皿如：培養皿，錐形瓶等，和各種鐵質的接種用具如：鑷子，剪刀，接種用刀等。

3.1.1 培養器皿滅菌。培養器皿多為玻璃材質，在使用前清洗干凈并放入烘箱中采取干熱滅菌法進行滅菌，以備培養基配制和接種實驗使用。

3.1.2 接種用具滅菌。接種用具多為鐵質，所以可以采取灼燒法滅菌。接種時接種用刀和鑷子等在進行多次使用后，放在酒精燈外焰上進行灼燒，達到滅菌目的，避免因接種用具上沾染細菌造成感染。

3.2 實驗藥劑滅菌

實驗藥劑配制完成后要進行滅菌處理，多采用高壓蒸汽滅菌法對接種所用培養基進行滅菌：將配制好的培養基倒入培養所用經過滅菌處理的培養皿中并封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行高壓蒸汽滅菌。注意滅菌后不宜馬上打開高壓蒸汽滅菌鍋，防止因培養皿內外氣壓引起培養皿封口膜被氣壓頂開。

4 其他污染防控方法

組培過程中可以在培養基中加入抗生素和抑菌劑來達到抑制細菌生長，控制污染的目的。

4.1 加入殺菌劑

組培污染病原菌主要為細菌和霉菌，以及少量酵母菌和放線菌。抗生素往往只對細菌或霉菌有抑 （殺）作用：一般用于防治病害的化學農藥等主要抑 （殺）霉菌，有些對細菌也有抑制作用；化學防腐劑往往對細菌和霉菌都有抑（殺）作用。因此，單一殺菌劑防制組培污染一般效果較差，并且容易使病原菌產生抗藥性，因此可以考慮加入多種殺菌劑[2]。

4.2 加入抗生素

我們選擇孔雀竹芋、天鵝絨竹芋、馬鈴薯、山藥、甘薯做接種的植物材料，抗生素選用硫酸慶大霉素、氯霉素，以及殺菌劑愛力克，其中加入愛力克全部培養基未經過高壓蒸汽滅菌，培養基配方共9種（見表1）。15天后觀察污染情況。未加入抗生素的孔雀竹芋5個配方平均污染率為35%、天鵝絨竹芋27.5%、馬鈴薯75%、山藥25%、甘薯55%；加入抗生素的孔雀竹芋5個配方平均污染率為4.38%、天鵝絨竹芋5.00%、馬鈴薯6.25%、山藥6.25%、甘薯3.125%。

4.3 嚴格控制環境和外植體消毒

鑒于第一次接種污染率過高，在對接種環境和外植體消毒條件進行嚴格把控后進行第二次接種實驗。接種環境消毒包括接種前使用紫外線燈照射30min，同時打開臭氧發生器并保證接種全程使其處于工作狀態。外植體消毒更加嚴格每次使用酒精和升汞消毒少量外植體，少量多次消毒，保證消毒過的外植體會立刻完成接種。

通過實驗數據可以看出，在相同接種情況下加入抗生素可以極大程度上降低外植體的污染率，其中加入愛力克的培養基甚至未經過高溫高壓滅菌器污染率依然低于正常培養基。并且嚴格控制接種環境和外植體消毒同樣可以達到降低外植體污染率的目的。

5 實驗結論

導致植物組織培養污染原因可歸結為3個方面：一是組織培養室或接種室的清潔問題；二是外植體自身帶菌；三是組織培養過程各環節操作不適宜或不嚴格。

但實驗中發現外植體交叉污染現象較為普遍，所以控制住外植體交叉污染情況同樣可以做到降低污染率的目的。

某些外植體如馬鈴薯，甘薯，山藥等的表皮不易消毒，在組培中選擇正確的外植體和消毒方式也是降低污染率的重要措施。

待解決問題：實驗過程中發現，在同樣培養時間和培養條件下，外植體在加入抗生素的培養基中的愈傷組織發生數量明顯低于未加入抗生素培養基上愈傷組織的發生數量。

參考文獻：

[1]周鵬，鄭學勤，陳向明.成齡番木瓜的快繁技術[J].熱帶作物學報，1995，16（2）：66-69.