唾腺染色體制片方法的簡化與改進

黃世全 王棚濤 郭思義

摘要 以果蠅、日蠅及其3齡幼蟲為研究對象，采用先染色后分離唾腺組織的方法簡化了唾腺染色體的制備過程。通過比較發現，日蠅可能是更適合

制備唾腺染色體的試驗材料。

關鍵詞 果蠅；日蠅；唾腺染色體；遺傳學實驗

中圖分類號 S-01 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）21-0234-03

Abstract Taking Drosophila melanogaster，Heleomyzidae and their thirdinstar larvae as research objects，the preparation process of salivary gland chromosome was simplified by using the method of firstly staining and then separating the salivary gland tissue.The results indicated Heleomyzidae might be more suitable for preparing salivary gland chromosome than other experimental materials.

Key words Drosophila melanogaster；Heleomyzidae；Salivary gland chromosome；Genetics experiments

唾腺染色體最早是1881年意大利細胞學家Balbiani在搖蠅幼蟲中發現的一種巨大染色體，由于存在于唾液腺細胞中，所以稱為唾腺染色體（salivary gland chromosome），是染色體常染色質區的核蛋白纖維不斷復制，但復制產物不分開，成千上萬條染色質纖維平行排列成寬大的帶狀物，又稱多線染色體（polytene chromosome），比一般染色體粗1 000～2 000倍，長100～200倍[1]。果蠅唾腺染色體制片與觀察是遺傳學教學的典型實驗之一。現今普遍采用的唾腺染色體制備方法是壓片法[2]。長期以來，許多研究者對該實驗方法進行了不斷優化，近幾年又有研究者從果蠅的培養方法、果蠅唾腺體的剝取、實驗過程中的解離處理、不同染色劑的比較以及后期圖片的處理等方面做了改進[1，3-12]。這些研究中實際操作都比較繁瑣，忽視了唾腺染色體“巨大”這個特點，唾腺細胞核也比其他細胞大，因此只要稍作染色，就能將果蠅唾腺體從頭部組織的口器、脂肪和食道管中分離開。此外，唾腺染色體普遍存在于蠅科幼蟲中，蠅科其他種可能也是唾腺染色體制片的優秀材料。筆者對唾腺染色體制片方法進行了簡化與改進，旨在為唾腺染色體的研究和實驗教學提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 果蠅及其3齡幼蟲、日蠅及其3齡幼蟲。

1.2 試劑 1%醋酸洋紅，采用常規方法配制。稱取1 g洋紅，加到100 mL 45%的醋酸溶液中，煮沸約5 min，懸入一生銹小鐵釘1 min，冷卻過濾并保存于棕色瓶中備用。

1.3 器材 顯微鏡、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、濾紙。

1.4 試驗方法

①取果蠅和日蠅3齡幼蟲置于載玻片上，用鑷子夾住幼蟲的尾部，用解剖針按住幼蟲頭部，輕輕拉出幼蟲的口器，帶出唾腺及其他組織。②滴加1滴1%的醋酸洋紅，染色約1 min后，置于顯微鏡載物臺上，使用4倍物鏡觀察唾腺組織，剔除口器、脂肪、食道管等其他組織部分。如果這些組織與唾腺組織聯結比較緊密，可用解剖針剖解，再去除非唾腺組織部分。③對著唾腺組織蓋上蓋玻片，蓋玻片一角墊上雙面刀片，按住另一邊，用鑷子輕敲幾下，去掉刀片，蓋上濾紙，垂直壓片后，即可使用顯微鏡進行觀察。

2 結果與分析

2.1 唾腺染色體制片方法的簡化

日蠅和果蠅同屬雙翅目，日蠅成蟲比果蠅大（圖1、2），3齡幼蟲也比果蠅大。無論是果蠅3齡幼蟲還是日蠅3齡幼蟲都很容易制備出唾腺染色體裝片。3齡幼蟲頭部被拉出并染色約1 min后，在4倍物鏡下可見清晰的頭部組織，包括口器、脂肪、唾腺、食道管等，其中唾腺組織是由許多大型唾腺細胞組成，細胞中間是染色比較深的細胞核，核內即為唾腺染色體，其他組織的細胞核比較小，因此很容易將唾腺組織與其他組織區分開來，便于剝離（圖3、4）。用解剖針移除口器和食道管，留下唾腺組織及其附著的少量脂肪（圖5、6），發現日蠅的唾腺組織比果蠅大。經壓片后，在40倍物鏡下能清晰地觀察到唾腺染色體的圖像，由于去除了口器和食道管等組織的混雜，所以圖片背景比較清晰（圖7、8）。這說明這種方法適用于果蠅和日蠅唾腺染色體的制片與觀察，尤其是實驗教學。

2.2 唾腺染色體制片材料的優化 在實驗過程中有時候拉出來的3齡幼蟲頭部組織排布比較規則（圖3、4），從形態上也可以將唾腺組織與口器、脂肪和食道管區分開。如果拉出的頭部組織排布不規則，唾腺組織和食道管就很難辨認，經過染色后，根據唾腺組織細胞核大、染色深等特點，比較容易將其與食道管區分（圖9、10）。日蠅無論是成蟲還是幼蟲都比果蠅大，分離唾腺組織時比較容易操作，壓片后唾腺染色體相差不大。自然環境中日蠅比較多，容易誘捕和培養。因此，在唾腺染色體制片和觀察實驗課中，選用日蠅作為實驗材料比果蠅更為理想。

3 結論與討論

3.1 唾腺染色體制片方法的簡化與改進 ①省略了一些器具和藥品。

在一些實驗指導和文獻中通常要使用雙筒解剖鏡、酒精燈、生理鹽水、固定液、HCl解離液、乙醇、背景凈化液、沖洗液等[1，3-6]。該方法不需要使用這些器具和藥品，在顯微鏡低倍鏡（4倍物鏡）下就可以分離唾腺組織和其他組織，因為步驟少、時間短，再加上1%醋酸洋紅具有一定的固定作用，唾腺細胞無細胞壁且間隙物質少，所以可以省略以上器具和藥品。②剝離唾腺組織前先染色。

在以往的方法中，剝離唾腺組織一般要在生理鹽水中進行，在鹽酸解離液中解離，或者在凈化液中處理以凈化背景，這些溶液對醋酸洋紅的染色有一定的影響，所以需要用水沖洗后才能加醋酸洋紅進行染色[1，3-12]。此外，唾腺與食道管等組織顏色相近，很難辨別，解剖后如果沒有及時確認，就會隨液體漂動，而與其他組織混為一體，故常常容易誤將食道管等當成唾腺，導致實驗失敗。在剝離唾腺組織前，對果蠅3齡幼蟲頭部組織進行染色，由于唾腺細胞體積大，唾腺染色體粗大，染色后很容易與其他組織部分區分開來，因此剝離出來的唾腺組織就比較干凈，背景干凈。由于操作過程中使用的試劑較少，醋酸洋紅染色受到的干擾就少，再加上在染液中剝離唾腺，又加快了醋酸洋紅的染色，所以染色時間就會縮短。

③實驗材料的改進。

以往的唾腺染色體制片和觀察實驗中，選用的實驗材料都是果蠅3齡幼蟲，但是果蠅3齡幼蟲比較小。選用日蠅作為實驗材料，更容易制備出比較理想的裝片。

3.2 建議 ①拉出3齡幼蟲頭部時，解剖針不宜太尖太鋒利，可稍微傾斜解剖針，以免割破口器而使整個頭部縮進幼蟲內部，也可以用牙簽或大頭針代替。

②剝取唾腺組織時，可將載玻片從顯微鏡載物臺上取下來，操作比較方便，但因為在顯微鏡看到的圖像與實際相反，即翻轉180°，所以將頭部各個組織分離開后，將載玻片置于顯微鏡下觀察唾腺組織，再去除其他組織部分。③敲打蓋玻片時用力要恰當，以唾腺組織完全分散，呈淺紅霧狀為宜，避免因用力不足而導致細胞重疊從而影響觀察效果，或者因用力過大而導致唾腺染色體斷裂而漂走。

參考文獻

[1]劉祖洞，江紹慧.遺傳學實驗[M].2版.北京：高等教育出版社，1987：9-13.

[2] 楊大翔.“果蠅唾腺染色體的制備與觀察實驗”的背景知識[J].生物學教學，2005，30（4）：37-39.

[3] 盧龍斗，常重杰，杜啟艷，等.遺傳學實驗技術[M].合肥：中國科學技術大學出版社，1996：27-30.

[4] 張志達.如何做好“果蠅唾腺染色體觀察”實驗[J].廊坊師專學報（自然科學版），1997（3）：45-46.

[5] 龐瑞媛，謝文海，李桂芬.唾腺染色體實驗方法的改進[J].玉林師范學院學報（自然科學版），2002，23（3）：89-90.

[6] 薛小橋，曾慶韜，楊勇.一種易于掌握的果蠅唾腺染色體制片方法[J].實驗室研究與探索，2000（5）：108-109，112.

[7] 胡甘.用于果蠅唾腺染色體實驗材料的培養方法[J].實驗科學與技術，2007（5）：38，52.

[8] 周志華.快速獲得果蠅唾腺體的技巧和方法[J].安徽農學通報，2017，23（21）：39-40，63.

[9] 王曉杰，董梅，王永香，等.鹽酸解離對果蠅唾腺染色體解聚與制片效果的影響[J].青島農業大學學報（自然科學版），2016，33（1）：24-26.

[10] 劉麗影，劉文靜，邵紅.果蠅唾腺染色體四種染色方法的比較[J].佳木斯大學學報（自然科學版），2007，25（3）：424-426.

[11] 倪奎.三種染色法對果蠅唾腺染色體制片優化設計[J].合肥學院學報（綜合版），2017，34（2）：79-83.

[12] 楊大祥，程劼，許也，等.果蠅（Drosophila melanogaster）唾腺染色體的制備及染色體識別[J].中國農業大學學報， 2014，19（1）：143-149.