紅菜薹離體再生體系的建立

王晨璐 陳龍正

摘要 [目的]為建立紅菜薹的離體再生體系，提高紅菜薹的生物技術育種效率。[方法]以紅菜薹帶柄子葉為外植體，選用TDZ、NAA兩種激素，進行離體組織培養。[結果]以帶柄子葉在1/2MS+TDZ 3.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L培養基上誘導效果最好，誘導率達9.8%，以MS+NAA 0.2 mg/L培養基誘導生根效果最好。[結論]該研究為在生物技術育種層面上的研究奠定基礎。

關鍵詞 紅菜薹;離體再生;建立

中圖分類號 S634文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0030-03

菜薹（Brassica campestris L.）又名菜心，是蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的菜薹變種[1]，原產于我國南部地區，是兩廣地區及海南、臺灣等地主要特菜之一。離體再生體系的建立在作物種質創新中具有重要作用，隨著轉基因技術、基因編輯技術的日益發展，離體高效率的再生體系顯得尤為重要。但是，蔬菜作物的離體再生相對困難，因此建立一套簡便實用的離體再生體系對種質創新、生物技術育種具有重要意義。

許多研究者采用菜薹的帶柄子葉、原生質體、游離小孢子等進行培養，均取得了一定的成果[2-4]。張鵬等[5]研究認為菜薹以子葉-子葉柄為外植體，不定芽誘導率最高。而何曉明等[6]則認為菜薹再生能力在不同品種間差異很大，Zhang等[7]指出大白菜的基因型對它的再生能力影響極大，雖然一些菜薹品種已經可以進行再生，但是由于材料的專一性強，許多未研究過的品種在基因工程技術方面的應用還是會受到限制。因此，筆者以未報道的紅菜薹為研究對象，以帶柄的子葉為外植體，探討TDZ、NAA等不同激素濃度對再生體系的影響，旨在為其在生物技術育種層面上的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 紅菜薹材料為TKD20170 種子由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供。

1.2 無菌苗的獲取

將種子放到無菌水中浸泡15～20 min;取出種子，用75%的酒精處理40 s，無菌水沖洗3次;最后放到30%雙氧水中浸泡15 min，再用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分等待播種。將種子接種于MS培養基中。25 ℃下黑暗中萌發2 d，然后移至16 h/d光照，3 000 lx 光強條件下培養。

1.3 分化培養

以5 d苗齡的幼苗為外植體材料。從中挑選健壯的幼苗，切取長0.5 cm左右帶柄子葉放入培養皿中，每個處理接種16～20個外植體。每個處理重復3次。接種后放置在25 ℃、2 500 lx光照強度、12 h/d光照時間的環境下進行培養。7 d后統計各處理的出芽數，計算分化率。

分化培養基：1/2MS培養基為基本培養基，添加不同濃度的TDZ、NAA等植物激素，形成不同的處理條件。T1～T9處理的激素添加的種類及用量見表1。

1.4 組培苗的生根培養

將外植體上分化出的不定芽剪切下來，轉到MS基本培養基上培養。待組培苗生長到5～6 cm，并且長出2到3片幼葉時，將其分別轉到0、0.1、0.2 mg/L NAA濃度的生根培養基中，促不定根萌發。30 d后取出與CK（0 mg/L）進行比較，篩選出合適的NAA濃度，用于誘導生根。

1.5 組培苗的移栽

組培苗接到生根培養基30～35 d后，待組培苗已長出不定根，用流水沖洗凈組培苗根系上的培養基，將其栽入已滅菌的基質中，其上覆蓋塑料膜，保持適合其生長的溫度、濕度、光照，10 d左右移栽大田，10 d后觀察其成活與否。

2 結果與分析

2.1 紅菜薹在不同激素配比的分化培養基上的誘導效果

將帶柄子葉接到T1～T9處理的分化培養基中，7 d后分別觀察不同處理的幼苗誘導數。觀察發現T1～T5處理只有愈傷產生，并無芽點形成。T6～T9處理中部分帶柄子葉有不定芽產生（圖1）。

T6、T7、T8處理盡管可以分化出不定芽，但分化率很低。T6處理分化率為1.79%、T7處理的分化率為2%、T8處理的分化率為3.85%。T9處理分化率可達9.80%，表明T9處理激素比例是最佳配比（表2）。

2.2 紅菜薹生根培養基的選擇

將外植體分化獲得的芽接種到MS基本培養基上培養（圖2A），10～20 d后可發育成小植株（圖2B）。獲得的無菌苗接到不同NAA濃度的培養基中進行生根培養（圖2C）。根據圖2D可知，含有0.2 mg/L NAA的培養基中長出的根數目最多，根細長、粗壯，植株生長勢最好。因此，紅菜薹無菌苗以0.2 mg/L NAA培養基誘導，最利于紅菜薹生根，并最終生長成苗（圖2E）。

3 結論與討論

許會會等[4]對麻葉薹菜研究發現，最適培養基為MS+BA 5 mg/L+ZT 2 mg/L+NAA 0.7 mg/L，分化率為67.8%。在此基礎上，筆者嘗試了十幾種在菜薹、菜心、不結球白菜、大白菜上已經報道的配方，這些配方在紅菜薹TKD201701上均未得到再生芽（數據未發表），推測這個紅菜薹基因型可能屬于頑拗型基因型。盡管比較難再生，但在該研究中，在培養基1/2MS+TDZ 3.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L上，紅菜薹仍然得到9.8%的分化率。在分化率統計上，許多研究利用再生的芽數/外植體數來計算，這樣比例很高。該研究利用試驗中能夠再生不定芽的外植體數/總外植體數來計算，客觀的反應一個基因型的難易程度。雖然，該研究中紅菜薹分化率不高，但是仍然為紅菜薹在基因工程方面的后續研究奠定了基礎。

在誘導菜薹不定芽分化的培養基上，盡管T1處理與T7處理、T2與T8處理、T3與T9處理的培養基都添加了等量的硝酸銀與萘乙酸，但是T1、T2、T3生理培養基上卻沒有芽再生，由此可見TDZ在芽的再生上起較大的作用。而隨著TDZ濃度的升高，再生率也變高，這同樣驗證了TDZ的重要性。低濃度的TDZ培養基中，不同濃度的NAA并不能起到提高再生率的作用。但是在高濃度TDZ培養基上，隨著NAA濃度的提高，其芽再生率也在變高。由此可見TDZ、NAA在誘導菜薹帶柄子葉的再生上都起到了一定的作用，但是TDZ的作用更關鍵。

參考文獻

[1]李曙軒，李樹德，蔣先明，等.中國農業百科全書·蔬菜卷[M].北京：農業出版社，1990：33-34.

[2]葉志彪，李漢霞.紅菜薹原生質體培養植株再生[J].園藝學報，1993，20（4）：405-406.

[3]王濤濤，李漢霞，張繼紅，等.紅菜薹游離小孢子培養與植株再生[J].武漢植物學研究，2004，22（6）：569-571.

[4]許會會，趙美愛，鈐泰琳，等.薹菜再生體系的建立[J].西北農業學報.2010，19（8）：198-201.

[5]張鵬，凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究[J].植物學報，1995，37（11）：902-908.

[6]何曉明，潘瑞熾.薹菜組織培養和植株再生研究[J].上海農業學報，200 17（2）：34-40.

[7]ZHANG F L，TAKAHATA Y，XU J B.Medium and genotype factors influencing shoot regeneration from cotyledonary explants of? Chinese cabbage（Brassica campestris L.ssp.pekinensis）[J].Plant Cell Rep，1998，17（10）：780-786.