香龍血樹組織培養研究

漆麗萍 馬劍 李劍美 李援龍 強繼業

摘要 [目的]通過香龍血樹組織培養技術研究，建立香龍血樹再生繁殖體系。[方法]以莖段作為外植體，探索最適滅菌時間以及誘導培養基及增殖培養基最適6-BA和NAA的濃度組合。[結果]滅菌最適宜時間9 min;以MS作為基本培養基，誘導培養最適的6-BA和NAA濃度組合：2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA易誘導長出叢芽，5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA易誘導形成愈傷組織;以MS作為基本培養基，增殖培養最適6-BA和NAA濃度組合：3.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。[結論]利用帶腋芽莖段作為組織培養的外植體可迅速建立香龍血樹離體快繁體系。

關鍵詞 組織培養;香龍血樹;帶腋芽莖段;快速繁殖

中圖分類號 Q943.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0071-04

龍血樹（Dracaena cambodian）屬于百合科龍血樹屬，樹葉為線狀披針形，簇生于枝條頂端，樹形極具特點，可塑性強，可以根據人的意愿塑造出不同形狀，樹干古樸滄桑，同時還能在頂部萌發新枝，給人一種沉穩而不失朝氣的感覺，且十分耐陰，可在室內盆栽多年仍然綠意盎然，是園林綠化及家庭盆栽的名貴樹種，具有很好的觀賞價值。同時藥用價值極高，具有止血、生肌、行氣等功效。

香龍血樹（Dracaena fragrans）是百合科龍血樹屬植物，別名也門鐵、大龍血樹、香千年木、巴西木、巴西鐵樹、山德氏龍血樹[1-4]。香龍血樹莖干挺拔，株形整齊，是重要的室內觀葉樹種; 其小花具有濃烈的香氣，因此是良好的香味樹種;它喜光照充足、高溫、高濕環境，耐陰、耐干燥，多生長于熱帶或亞熱帶地區[5]。也門鐵具有綠葉也門鐵品種，后來又相繼出現了金心也門鐵、金斑也門鐵和金邊也門鐵新品種，成為近年來異軍突起的時尚觀葉植物新寵[6]。香龍血樹為單莖直立灌木，葉叢生于莖頂，無柄葉長寬線形，葉緣具波紋，呈深綠色，常見品種包括金邊香龍血樹（cv.Victoriae），葉緣深黃色帶白邊;金心香龍血樹（中斑香龍血樹）（cv.Massangeana），葉面中央具黃色縱條斑;黃邊香龍血樹（cv.Linderi），葉緣淡黃色;銀邊香龍血樹 （cv.Lindeniana） ，葉片邊緣乳白色[4，7]。這些品種與上文提到的也門鐵新品種是相同變種。

2007年春，廣東大規模推廣種植的也門鐵呈現爆發式開花，開花率為80%～90%，而按照以往種植經驗也門鐵是很少開花，尤其是種植3年以下的幼株鮮有開花，由于花后死亡的傳言讓漂亮成品滯留花場，但也門鐵爆發式開花涉及內因和外因，原因尚待考證[8]。實際上香龍血樹需經過多年才能進入開花期，香龍血樹室內栽培很少開花，觀察發現，香龍血樹在北方室內栽培13年才首次開花，香味濃烈，但開花后不能結果[5]。香龍血樹目前多采用扦插法繁殖[ 7]。但由于香龍血樹為直立單莖灌木，分枝極少，扦插繁殖不能滿足大規模種苗需求，而組織培養途徑可以有效地解決市場種苗短缺的問題[2]。目前關于香龍血樹組織培養方面的研究報道較多，組織培養多采用MS作為基本培養基，培養基中添加的植物生長調節物質有6-BA、IAA、IBA、KT、NAA等，通常以頂芽、嫩莖段、腋芽、葉片作為外植體進行接種，都取得了較好的結果[2，9-13]。筆者對香龍血樹品種的組織培養技術進行研究，以期建立龍血樹品種快速繁殖體系，為滿足園林綠化苗木和市場對藥用資源的需求并進行規模化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 香龍血樹頂芽和帶腋芽莖段取自于喜慶園林責任有限公司，取材時間是正午。

1.2 方法

1.2.1 外植體預處理。采集外植體前應對母株或器官的生長環境進行評估（有害微生物的滋生程度），這是滅菌的重要依據。為了減少在組織培養中的褐化，可以對材料進行避光保濕（用濕潤的毛巾包裹，裝到避光處理的容器中），然后對外植體進行修整，切除枝條上的葉片及附屬物，用軟毛刷在流水下進行刷洗，清洗好以后，用毛巾把水吸干，然后將外植體剪成帶2～3個節的莖段，最后再用流水沖洗。龍血樹屬于木本植物，容易褐化，所以材料需要在流水下沖洗12 h，才能徹底沖洗凈外植體表面所附帶的泥土、蟲卵、病菌孢子。

1.2.2 外植體滅菌。對預處理的外植體用75%乙醇擦拭，然后拿到超凈工作臺上用紫外燈消毒30 min，接著用0.1%升汞消毒處理5～10 min，每種處理用20個外植體。將外植體接種于MS培養基中，45 d后統計外植體的污染率、存活率，篩選龍血樹外植體最佳消毒時間。污染率指污染芽數占總接種芽數的比例;死亡率指未污染芽中死亡芽數占總接種芽數的比例;存活率指未污染芽中存活芽數占總接種芽數的比例。

1.2.3 香龍血樹誘導培養。以帶腋芽莖段為外植體接種到誘導培養基上，誘導培養基配方：MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+6-BA+NAA，6-BA設置2.0、5.0 mg/L 2個濃度，NAA設置0.20、0.50、1.00 mg/L 3個濃度。6種誘導培養基配方見表 每個培養基處理接種20個外植體。

1.2.4 香龍血樹增殖培養。以誘導培養獲得的不定芽為外植體接種到增殖培養基上，增殖培養基配方：MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+6-BA+NAA，6-BA設置2.0、3.0 mg/L 2個濃度，NAA設置0.05、0.10、0.50 mg/L 3個濃度。6種增殖培養基配方見表 每個培養基處理接種10個外植體。

1.3 誘導培養和增殖培養條件 溫度（25±2）℃，光照時間12～14 h/d，光照強度1 500～3 000 lx，光質為T4燈管發出的光。

1.4 統計公式 各處理均在培養45 d后統計結果，記錄誘導率、出芽情況、芽增殖倍數及生長狀況。誘導率=[形成愈傷組織的莖段數/（接種總的莖段數-污染數）]×100%;芽增殖倍數=（增殖后芽總數/增殖前芽個數）×100%。

1.5 統計分析? 數據采用Excel 2010進行分析。

2 結果與分析

2.1 外植體最佳滅菌時間篩選 由表3可知，滅菌9 min效果最好，滅菌存活率最高，死亡數相對較低，污染率較低。

2.2 外植體誘導培養

由表4可知，外植體在接種45 d后，1～6號培養基都有愈傷組織形成（圖1），其中4號培養基誘導形成愈傷組織數量最多，誘導率為40%，其次為3號培養基，誘導率為35%。由此可見，MS+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA更易誘導形成愈傷組織，并具有分化能力;1～6號培養基都誘導長出芽（圖1），其中1號培養基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA）更易誘導長芽。綜合看來初代培養中每種培養基都有較好的效果。

2.3 不定芽增殖培養 從表5可以看出，8號和11號培養基增殖倍數最高為2.0，8號培養基不定芽有2株長出根，生長良好（圖2），11號培養基不定芽長勢好，葉片綠;7號培養基增殖倍數為1.9，但不定芽生長緩慢，有一些開始變黃;9號和10號培養基增殖倍數為1.6，9號培養基不定芽長根同時帶有紅色分泌物附著在培養基表面，10號培養基不定芽長勢不明顯，有紅色分泌物附著在培養基表面（圖3）;12號培養基增殖倍數最低為1.5，但不定芽長勢好，葉片綠。綜合看來11號培養基增殖效果最好（圖4）。

3 結論與討論

組培香龍血樹用到的是長了2～3個月的枝條，選用的都是解剖刀能切割下來的帶腋芽莖段，外植體滅菌過程中要根據植物的生長環境以及生長時間來制定滅菌時間，需嚴格執行，探索中發現用升汞滅菌9 min能達到滅菌效果，誘導過程中存活數最高，死亡數較少，這與黃莉雅等[14]研究結果一致。

香龍血樹接種在培養基MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA上更容易誘導長出叢芽，在培養基MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA上更容易誘導形成愈傷組織，形成的愈傷組織經誘導分化能長出生長健壯的苗。

血竭來源于自然界中生長10年以上的龍血樹，這種龍血樹受到刻傷、病害、蟲害，才會分泌一種紅色的液體附在傷口表面，在增殖培養中發現，有些培養基表面附有一些紅色分泌物，可能是血竭。楊本鵬等[15]在海南龍血樹組織培養過程中進行了不同生長調節劑及濃度對血竭形成誘導的研究，結果表明在含有GA3、 KT、 AD、 NAA、2，4-D和 IAA這 6 種生長調節劑的培養基上均不產生紅色，只有在含 6-BA的培養基上才能誘導龍血樹無菌組培苗產生血竭，且誘導血竭與6-BA濃度無關。該試驗中每種培養基均含有6-BA，但并不是所有培養基均能產生紅色分泌物，可能是由于除了6-BA外，培養基中還含有NAA;也可能是取材不同造成的。該研究中的香龍血樹形成“血竭”對生長調節劑和濃度要求與海南龍血樹不一樣。在組培過程中生產出血竭是非常有意義的，能有效地推動藥用植物在組培過程中的實踐與發展，但該試驗中紅色分泌物是否為血竭結果還有待證實。

繼代培養過程中2.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA組合培養基上長出了根，對組培苗馴化，將其移栽到自然環境中，有1株和其他香龍血樹明顯不一樣，在葉片上出現了金邊（圖5a），而野生型植株葉色表現全綠（圖5b），可能是體細胞變異，使香龍血樹表現型出現了差異，雖然市場上已經有金邊香龍血樹，但該研究中的金色葉緣變異和現有的金邊性狀還存在很大差異，可能是一種新的變異類型。這種變異產生的原因是否屬于可遺傳的變異，以及后代能否100%保持這種變異還有待進一步研究。

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