山葡萄北冰紅VvCOR413—I1基因克隆及生物信息學(xué)分析

王學(xué)娟

摘要 [目的]從山葡萄北冰紅中克隆耐寒基因COR413，并對(duì)其功能進(jìn)行生物信息學(xué)分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰紅基因COR413，并利用生物信息學(xué)對(duì)其進(jìn)行分析。[結(jié)果]它包括630 bp完整的開(kāi)放閱讀框，推測(cè)編碼210個(gè)氨基酸，蛋白的分子量（MW）為59.18 kD，等電點(diǎn)（pI）值為10.74。其蛋白結(jié)構(gòu)以α-螺旋、延伸鏈為主，其次為無(wú)規(guī)則卷曲，β-轉(zhuǎn)角所占比例最少，含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。多重序列比對(duì)表明VvCOR413-I1與其他植物COR413的氨基酸序列相似性為63.00%～68.33%。[結(jié)論]該研究為深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 冷適應(yīng)蛋白基因（COR413）；山葡萄北冰紅；克隆；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）14-0109-04

Cloning and Bioinformatic Analysis of VvCOR413-I1 Gene from Beibinghong Amur Grape

WANG Xuejuan （College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）

Abstract [Objective]The coldtolerant gene COR413 was cloned from the Beibinghong Amur grape， and its function was inferred through bioinformatics analysis.[Method]The RTPCR method was used to clone COR413， a coldtolerant gene from the Beibinghong Amur grape， and its molecular characteristics were analyzed by bioinformatics to infer the function of COR413 gene.[Result]The ORF of COR413 was 630 bp and the deduced amino acid sequence was 230 amino acids.Furthermore，its protein had a MW of 59.18 kD and an isoelectric point （pI） of 10.74. The structure of the protein was dominated by αhelix and elongation chain， followed by random coil，the proportion of βturn was the smallest， containing 4 transmembrane domains.Multiple sequence alignment showed that the amino acid sequence similarity of COR413 with other plants was 63.00% to 68.33%.[Conclusion]The study laid the foundation for an indepth understanding of VvCOR413I1 function.

Key words Coldregulated gene （COR413）；Beibinghong Amur grape；Clone；Bioinformatic analysis

溫度脅迫是重要的非生物脅迫因子之一，其對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、花期、果期等產(chǎn)生重要的影響。植物接受不利溫度的逆境信號(hào)后，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脅迫蛋白的表達(dá)。冷適應(yīng)蛋白（coldregulated， COR413）基因作為植物特有的一類(lèi)低溫脅迫響應(yīng)功能基因，在抗寒過(guò)程中發(fā)揮重要作用。冷馴化擬南芥轉(zhuǎn)錄組研究表明，COR413基因受低溫調(diào)控，被稱(chēng)為低溫誘導(dǎo)基因[1-2]。在植物COR413基因中含有CRT元件，CRT元件與CBF相互結(jié)合后引起COR413的表達(dá)，但是CBF的調(diào)控受到ICE的調(diào)控，ICE是一種組成型表達(dá)的蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)的泛素化是通過(guò)磷酸化來(lái)進(jìn)行識(shí)別和調(diào)控的[3-4]。植物耐寒COR413已在多種植物中被克隆出來(lái)，并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。植物耐寒分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由多個(gè)基因協(xié)同作用在耐寒信號(hào)通路以抵御冷害，但有報(bào)道表明，單轉(zhuǎn)COR413基因也能提高植株的耐寒性，如罌粟、菠菜、播娘篙等[5-7]。筆者以山葡萄北冰紅為材料，利用RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)，獲取其耐寒基因VvCOR413-I1，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為研究其功能和耐寒分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 取山葡萄北冰紅新鮮葉片為供試材料。Ex Taq DNA聚合酶、克隆載體PMD18-T、膠回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，感受態(tài)細(xì)胞JM109保存于內(nèi)蒙古民族大學(xué)植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)室，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 山葡萄北冰紅總RNA的提取及引物設(shè)計(jì)。使用Trizol提取法提取總RNA，幾乎沒(méi)有DNA和蛋白質(zhì)污染，其純度較高，具有較好的效果。根據(jù)葡萄基因組（https：//phytozome.jgi.doe.gov/ pz/portal.html）設(shè)計(jì)特異性上下游引物，并命名為VvCOR413-I1-F和VvCOR413-I1-R（表1）。

1.2.2 VvCOR413-I1全長(zhǎng)cDNA的克隆。葉片總RNA提取及cDNA第一鏈合成嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以cDNA為模板，利用Ex-Taq Buffer，Ex-Taq，dNTP Mixture （2.5 mmol/L each）和引物VvCOR413-I1-F、VvCOR413-I1-R擴(kuò)增VvCOR413-I1全長(zhǎng)。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 40 s， 72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察分析并拍照。PCR產(chǎn)物用北京索萊寶科技有限公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，克隆載體選用pMD18-T Vector，從-20 ℃冰箱中取出目的片段，在冰盒上融化后與克隆載體連接，反應(yīng)條件：16 ℃ 9 h。取200 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞與10 μL重組質(zhì)粒于同一試管中，用移液器輕輕混勻，將離心管至于冰水浴中30 min，42 ℃溫水浴90 s，冰水浴5 min，37 ℃溫水浴5 min，然后加入800 μL液體LB培養(yǎng)基，在200 r/min的條件下，保持37 ℃不斷搖菌2～3 h。將菌落PCR（反應(yīng)體系和條件同VvCOR基因克隆）和酶切驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送至北京華大基因測(cè)序。

1.2.3 VvCOR413-I1生物信息學(xué)分析。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定克隆獲得VvCOR413-I1基因cDNA序列完整開(kāi)放閱讀框。利用TMHMM、SOPMA、NetPhos3.1 Server等生物學(xué)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄北冰紅葉片總RNA活性的檢測(cè) 將提取好的總RNA用DEPC水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)缓笸ㄟ^(guò)瓊脂糖凝膠電泳（圖1），并檢測(cè)其純度OD260/OD280=2.10，其純度較好，可滿(mǎn)足下一步試驗(yàn)要求。

2.2 VvCOR413-I1克隆

采用RT-PCR法克隆葡萄VvCOR413-I1，利用設(shè)計(jì)的全長(zhǎng)特異性引物，擴(kuò)增得其cDNA全長(zhǎng)633 bp（圖2）。

2.3 VvCOR413-I1鑒定

挑取陽(yáng)性菌進(jìn)行PCR鑒定，同時(shí)提取陽(yáng)性菌的質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，結(jié)果見(jiàn)圖3、4。從圖3、4可看出，菌液PCR和雙酶切電泳結(jié)果顯示條帶都為650 bp左右，與克隆結(jié)果一致，推斷VvCOR413-I1成功導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)中，并與克隆載體構(gòu)建成功。

2.4 葡萄VvCOR基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 VvCOR413-I1序列分析。利用DNAMAN軟件對(duì)獲得的VvCOR413-I1全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，包括630 bp完整的開(kāi)放閱讀框，可推測(cè)編碼210個(gè)氨基酸的多肽，分子量為59.18 kD，等電點(diǎn)（pI）值為10.74，pH =7.0時(shí)電荷為13.05。利用NCBI的Conserved Domains （http：//www.ncbi.Nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb/cgi）預(yù)測(cè)基因保守區(qū)，結(jié)果表明VvCOR413-I1含有蛋白家族保守區(qū)，表明該蛋白與COR413蛋白家族具有相似的功能（圖5）。利用NetPhos3.1 Server對(duì)VvCOR413-I1氨基酸序列分析表明，它含有13個(gè)Ser、5個(gè)Thr、1個(gè)Tyr為磷酸化結(jié)合位點(diǎn)（圖6）。植物受到脅迫時(shí)，VvCOR413-I1磷酸化快速直接參與酶的作用機(jī)制，并介導(dǎo)蛋白活性，以應(yīng)對(duì)不利的生存條件。

2.4.2 VvCOR413-I1編碼的氨基酸序列同源性比對(duì)。利用DNAMAN軟件對(duì)VvCOR413-I1與其他植物的COR413氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比（圖7）。結(jié)果表明，VvCOR413-I1與其他植物的COR413蛋白同源性均為63.00%以上，其中與土瓶草的COR413蛋白的同源性最高，為68.33%。

2.4.3 VvCOR413-I1結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析。運(yùn)用DNAMAN和SOPMA軟件預(yù)測(cè) VvCOR413-I1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，表明該蛋白約含39.05%的α-螺旋，30.00%的延伸鏈，8.10%的β-轉(zhuǎn)角，22.86%的無(wú)規(guī)卷曲（圖8）。利用軟件TMHMM對(duì)

VvCOR413-I1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，VvCOR413-I1的氨基酸序列中共有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)（圖9），而且其4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域與其他植物的COR413蛋白高度相似。VvCOR413-I1蛋白的結(jié)構(gòu)域分析表明，其含有植物耐寒蛋白的COR413結(jié)構(gòu)域和該家族的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，并存在4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)與TMHMM分析結(jié)構(gòu)一致（圖10）。

3 結(jié)論與討論

利用RT-PCR的方法成功克隆了VvCOR413-I1全長(zhǎng)，其包括630 bp完整的開(kāi)放閱讀框，推測(cè)編碼230個(gè)氨基酸。VvCOR413-I1蛋白的分子量（MW）為59.18 kD，等電點(diǎn)（pI）值為10.74，含有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。多重序列比對(duì)表明VvCOR413-I1與其他植物COR413蛋白的氨基酸一致性為63.00%～68.33%。

隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)植物COR413基因及其應(yīng)對(duì)冷、寒逆境脅迫應(yīng)答方面研究較多，且對(duì)COR413蛋白功能研究及耐寒分子機(jī)制探索有了突破性進(jìn) 展。對(duì)擬南芥耐寒COR413基因的研究表明，CBF基因表達(dá) 可以調(diào)節(jié)COR基因的表達(dá)能力，同時(shí)COR基因的啟動(dòng)子含有CRT/DRE元件，通過(guò)COR413基因自身表達(dá)和聯(lián)動(dòng)表達(dá)模式，提高擬南芥的耐寒性[8]。與此同時(shí)，在山葡萄COR413基因家族中已發(fā)現(xiàn)4個(gè)成員，通過(guò)耐寒試驗(yàn)研究表明，COR413基因家族具有提高植物耐寒能力的功能，但不同種間表達(dá)量存在差異[9]。筆者對(duì)山葡萄北冰紅的VvCOR413-I1基因進(jìn)行克隆，并在分子水平上對(duì)其特性進(jìn)行分析，為研究其功能和利用基因工程手段培育葡萄耐寒品種奠定了基礎(chǔ)。

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