液相色譜-串聯質譜法測定文蛤中3種腹瀉性貝類毒素

張秋云 朱曉華 楊洪生 沈美芳 譚秀慧 夏莉萍

摘要 [目的]以文蛤中的腹瀉性貝類毒素大田軟海綿酸貝類毒素（OA）、鰭藻毒素-1（DTX1）、鰭藻毒素-2（DTX2）為研究對象，建立腹瀉性貝類毒素的超高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）檢測方法。[方法]以文蛤樣品為代表，用甲醇提取，采用堿水解將乙酰酯化的OA、DTX1、DTX2轉化成游離OA、DTX1、DTX 通過Strata-X柱凈化，過膜后，用液相色譜-串聯質譜測定，以基質標準曲線進行外標法定量。該試驗以流動相A為水溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），流動相B為乙腈溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），流速350 μL/min，柱溫40 ℃，負離子掃描，多反應監測模式下進行定性與定量分析。[結果]3種腹瀉性貝類毒在1～100 μg/L關系良好，3個添加水產的回收率都在75%～90%，RSD都在3.0%～6.6%。[結論]利用此方法檢測文蛤中的腹瀉性貝類毒素具有靈敏度高、重復性好、操作簡單的特點?；厥章实染軡M足日常對3種常見的腹瀉性貝類毒素的檢測要求。

關鍵詞 腹瀉性貝類毒素;液相色譜-串聯質譜;文蛤

中圖分類號 TS254.7文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0166-03

腹瀉性貝類毒素（diarrhetic shellfish poisoning，DSP）是由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬的一些種類產生的脂溶性多環醚類生物活性物質，不易溶于水，熱穩定性極高[1]，主要包括大田軟海綿酸貝類毒素（OA）、鰭藻毒素-1（DTX1）、鰭藻毒素-2（DTX2）[2]。該毒素可在貝類等濾食性動物體內富集，通過食物鏈傳遞至人類，引起腹瀉性中毒，危害食用者健康[3]。腹瀉性貝類毒素在全球沿岸海域均有分布，是世界范圍內最具威脅的赤潮藻毒素之一。腹瀉性貝毒雖然不是一種可致命的毒素，通常也只是引起輕微的腸胃疾病，而且癥狀消失也較快，沒有強烈的急性毒素，但是大田軟海綿酸貝類毒素是強烈的致癌因子，其長期毒性應該引起重視。目前常用腹瀉性貝類毒素檢測分析方法主要包括小鼠生物法[4]、液相色譜法[5]、液相色譜-質譜聯用法[6]、細胞毒性檢測法[7]、免疫熒光層析檢測法[8]等。小鼠生物法主要缺陷是操作繁瑣，不能確定樣本中毒素成分和結構;免疫熒光層析檢測法檢測成分假陽性率較高，結果不能代表樣本整體毒性;液相色譜法需要繁瑣的衍生步驟，衍生試劑存在性質不穩定等問題，可能會導致DSP不能夠完全衍生化[9-12]，而且對結構類似物不能有效地分離，在靈敏度和選擇性上還有待改進;液相色譜-串聯質譜檢測方法結合了質譜強大的定性定量功能和液相色譜優越的分離能力，現在越來越多地被應用到腹瀉性貝類毒素的分析檢測中。

筆者建立了3種代表性DSP毒素OA、DTX1、DTX2的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試材 OA、DTX1、DTX2 標準品購自加拿大海洋生物科學研究所（NRC）。色譜級甲醇（TEDIA公司），色譜級乙腈（TEDIA公司），色譜級甲酸、色譜級氨水（ROE公司），色譜級甲酸銨（含量≥99.0%），色譜級氫氧化鈉（含量≥980%），實驗室用水為超純水。文蛤購買于南京市某水產品市場。

1.2 儀器

1290 型高效液相色譜（美國 Agilent 公司），AB 4500Trap 三重四級桿液質聯用儀（Applied Biosystems C），TE612-L型電子天平（S 公司），Allegra 64R型高速冷凍離心機（BECKMAN COULTER 公司），Maxi Mix Ⅱ型旋渦混勻儀（美國 Thermolyne 公司），烘箱。

1.3 標準溶液的配制

根據需求，分別吸取適量的各腹瀉性貝類毒素標準溶液于5 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋并定容，配制成標準儲備液。用空白基質液稀釋儲備液配制成各個不同濃度的標準工作液。各類標準溶液避光保存于-12 ℃。

1.4 樣品預處理

準確稱?。?.00±0.05） g樣品于25 mL離心管中，加入4.5 mL甲醇，渦旋混勻后，超聲5 min，離心5 min，取重復提取1次，合并上清液用甲醇定容至10 mL。取1 mL中提取液，加入125 μL 2.5 mol/L氫氧化鈉溶液，于76 ℃溫育40 min。冷卻后，加入125 μL 2.5 mol/L鹽酸。水解液用3 mL水稀釋，過Strata-X柱（Strata-X柱活化：1 mL 甲醇，1 mL 30% 甲醇），再用1 mL 20%甲醇淋洗，用1 mL 03% 氨水甲醇洗脫，收集洗脫液。用0.22 μm的有機濾膜過濾，供超高效液相色譜串聯質譜分析。

1.5 LC-MS/MS 分析條件

1.5.1 色譜條件。

色譜柱：Agilent C8（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）;柱溫40 ℃;進樣量為10 μL，流動相：A為水溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），B為乙腈溶液（含2 mmol/L甲酸銨和1‰甲酸），采用等度洗脫方式，A/B=20/80（V/V）;流速350 μL/min。

1.5.2 質譜條件。

離子源：電噴霧離子源 ESI;掃描方式：負離子（ESI-）掃描;檢測方式：多反應監測模式（MRM）;噴霧電壓：-4 500 V;離子源溫度：550? ℃;氣簾氣壓力：206.8 kPa;霧化氣壓力：379.2 kPa;輔助加熱氣壓力：379.2 kPa。碰撞氣CAD：Medium。

2 結果與分析

2.1 質譜分析條件的優化

該試驗采用ESI源，多反應監測（MRM）。母離子的選擇（Q1 Scan）將用50%甲醇水溶液稀釋的標準毒素溶液，采用以10 μL/min流速的流動注射泵進樣分析，在負離子模式下進行一級離子掃描，尋找各毒素的母離子分子離子峰OA（[M-H]-，m/z 803.5）、DTX1（[M-H]-，m/z 817.5）、DTX2（[M-H]-，m/z 803.5），然后，在離子掃描模式下（Product lon MS2）選擇干擾性較小、信號強度較高的2個子離子，在多反應監測模式（MRM）下建立合適的MRM離子對通道，優化并獲得最佳的去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）。各個毒素選擇的母離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）參數見表1。

2.2 流動相的選擇

流動相的pH和在純溶劑中添加的物質會影響目標化合物的峰型和保留時間。該試驗分別采用乙腈-水、乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨）、乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相，經測定分析發現，乙腈-水作為流動相時峰型較寬，響應值較低;而乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨）作為流動相時，3種DSP的峰型較好，靈敏度提高;乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相，對3種DSP的響應值有所抑制。但是在實際檢測已經添加含有3種DSP的文蛤樣品時發現，在乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨）作為流動相時，響應值很低，幾乎不出峰，在乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相時，響應值較高，峰型較好，甲酸能有效地降解基質中某些雜質的干擾，流動相的pH對3種DSP毒素的影響較大。因此最終選擇了乙腈-甲酸銨（含有2 mmol/mL甲酸銨，0.1%甲酸）作為流動相。

為了能使3種DSP分離開，通過流動相條件的篩選，最終選擇梯度洗脫的方式分離毒素。流動相A：水溶液，流動相B：乙腈溶液，二者均含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸;0.01～7.00 min流動相B的比例從20%升高至90%;7.00～10.00 min，維持90%流動相B;10.00～10.01 min，流動相B降為20%，平衡色譜柱2 min。流動相梯度洗脫條件見表 在此流動相洗脫梯度下的3種DSP的總離子流圖見圖1。

2.3 凈化條件的優化

選用3種不同的固相萃取柱Strata-X柱、HLB柱和C18柱進行凈化效果分析比較，結果顯示，Strata-X柱OA、DTX1、DTX2回收率都可以達到70%以上。HLB柱和C18柱3種DSP各目標組分的回收率都低于60%。因此綜合考慮，最終選擇的固相萃取柱為Strata-X柱。

2.4 溫度條件的選擇

選擇在室溫下靜置40 min、50 ℃溫育40 min、76 ℃溫育40 min的3種試驗效果對比分析，結果顯示，在76 ℃溫育40 min下OA、DTX1、DTX2加標回收率最高，而且能夠有效地去除一些雜質基質的干擾。因此該試驗選擇76 ℃溫育40 min作為溫度條件。

2.5 基質效應影響

采用LC-MS/MS檢測時，基質效應會直接影響目標物的測定結果。為了測定基質對3種DSP測定的結果影響，用文蛤空白樣品的基質液和提取溶劑（50%甲醇水）分別配置了同一濃度的標準溶液上機分析。結果發現，用空白基質液配置的DSP標準溶液的響應值明顯偏低，表明基質對DSP的響應值有抑制作用。為了提高DSP的檢測結果的準確性，因此選擇采用空白基質液配制DSP系列的標準工作液。

2.6 線性關系和檢出限

用空白基質液分別配制OA、DTX1、DTX2質量濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、100.00 μg/L的混合標準溶液系列，按試驗方法進行測定，繪制標準曲線，線性回歸方程及相關系數表見表3。結果表明，各元素的線性范圍為1.00～100.00 μg/L，3種脂溶性貝類毒素的相關系數均達0.999以上。

2.7 回收率與精密度

在空白文蛤樣品中添加3個濃度水平的DSP混合標準溶液，每個添加水平6個平行樣品，計算回收率和測定值的相對標準偏差（RSD），結果如表4。由表4可知，各毒素的加標回收率都在75%～90%，RSD都在30%～6.6%。

3 結論

該研究建立了同時測定腹瀉性貝類毒素OA（大田軟海綿酸）及其衍生物DTX1（鰭藻毒素-1）和DTX2（鰭藻毒素-2）的超高效液相色譜-串聯質譜法。該方法前處理比較簡單，靈敏度高，重現性好，方法的回收率等均能滿足日常對DSP的檢測要求，適用于實際樣品的檢測分析。

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