西南地區民族習用藥香龍肝香（杠香）的品種鑒定

張丹雁 范紫穎 馬換換 林如意 趙維波 梁耀勇 李偉

摘要 [目的]鑒定云川貴民族習用藥香龍肝香（杠香）的原植物品種，保護和開發民族藥用新資源。[方法]實地調研、采訪，采集龍肝香（杠香）原植物，收集標本，用基原鑒定法、性狀鑒定法以及DNA條形碼技術鑒別龍肝香（杠香）原植物品種。 [結果]龍肝香（杠香）的藤本植物形態、香藥材性狀特征及DNA條形碼特征與豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）相吻合。[結論]云川貴民族習用藥香龍肝香（杠香）來源于豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀富含樹脂的木質藤莖。

關鍵詞 龍肝香；杠香；藥香；滇黔黃檀；品種鑒定

中圖分類號 R282.71文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0011-03

Abstract [Objective] The research aimed to identify original plant variety of Longganxiang （Gangxiang） which was conventionally used as medicine and spice in Yunnan，Sichuan，Guizhou Province，and to provide basis for protection and development of new medicinal resources for the nation. [Methods] Field surveys，interviews and collection of the original plants of Longganxiang （Gangxiang），and to collect the plant samples. Next，germplasm origin identification method，character identification method and DNA barcode technology was used to identify the original plant varieties of Longganxiang（Gangxiang）. [Result] The morphological characteristics，macroscopic characters and DNA barcode information of Longganxiang （Gangxiang） were accordant with Dalbergia yunnanensis Franch.. [Conclusion] Longganxiang （Gangxiang） which conventionally used in Yunnan，Sichuan，Guizhou Province was derived from Dalbergia yunnanensis Franch. resinrich woody cane.

Key words Longganxiang；Gangxiang；Chinese medicine and spices；Dalbergia yunnanensis Franch.；Variety identification

長期以來，云南、四川及貴州等地少數民族在襲用一種名為龍肝香、杠香、藤香、秧青、紫降及云香等稱謂的富含樹脂的藤本木質香材作為心血管、胃腸道及外傷常見疾病防治的民間藥，以及道觀祭祀香料，具悠久的藥用及香用歷史。此外，龍肝香（杠香）木質致密、花紋美觀，氣味芳香怡人，亦深受香道廣大愛好者的青睞，并開始盛行于香料文玩市場。龍肝香（杠香）作為西南少數民族地區藥香兩用原料，其原植物廣泛分布于云南、四川、貴州及廣西等地，資源豐富，然而這個被當地民眾和香佛文玩工藝市場大量使用的藤類香材究竟來源于何物種，至今尚未明確，且名稱頗多，各地叫法混亂。鑒于龍肝香（杠香）獨特的香藥兩用價值，為挖掘和開發民間藥用新資源，筆者通過實地考察，收集香材原植物標本，對其進行物種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

龍肝香（杠香）原植物及其香材采自云南省大理市及龍陵縣山區；樣品均保存于廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室。

1.1.2 試劑。天根植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP305]；Goldview（Life Technologies，美國）；Agarse（Life Technologies，美國）；6×Loading buffer（Thermo，美國）；PrimeSTAR HS Premix（TaKaRa，大連）；DL2000 DNA Marker（Bioteke，北京）；rbcL序列引物（由深圳華大基因科技有限公司合成）。

1.1.3 儀器。1-15型臺式高速離心機（德國Sigma有限公司，德國）；T100型PCR擴增儀（美國伯樂有限公司）；JY1000C電泳儀（上海京工實業有限公司）；K-WHS型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；Eppendorf Research plus微量移液器（艾本德中國有限公司）；Precisa XS 125A型電子分析天平（瑞士Precisa有限公司）；Lab Dancer/MS3型渦旋混合儀（德國IKA有限公司）；HR-220型掌上離心機（北京鼎昊源科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基原鑒定及性狀鑒定。通過實地調研、采訪，觀察龍肝香（杠香）原植物生長狀況和形態特征，采集標本并記錄描述其形態及香材性狀特征，鑒定原植物品種。

1.2.2 DNA條形碼鑒別。

1.2.2.1 樣品前處理。將采集得到的新鮮葉片迅速置入裝有變色硅膠的密封袋中，以使盡量干燥完全。

1.2.2.2 樣品DNA提取。提取方法參照植物天根DP305基因組DNA提取試劑盒操作指南進行部分調整：①取經硅膠干燥后的葉片30 mg，加入等量石英砂，充分研磨。②將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有800 μL 65 ℃預熱緩沖液GP1的離心管中（試驗前在預熱的GP1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1%），迅速顛倒混勻后，將離心管放在65 ℃水浴20 min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數次。③加入800 μL氯仿，充分混勻，12 000 r/min 離心5 min。④將上一步所得上層水相轉入新離心管中，加入800 μL緩沖液GP2，充分混勻。⑤將混勻的液體轉入吸附柱CB3中，12 000 r/min 離心30 s，棄掉廢液。⑥向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。⑧重復操作步驟⑦。⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑩將吸附柱CB3轉入離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。B11重復步驟⑩。B12將收集到的共100 μL 洗脫緩沖液TE加入到吸附柱CB3中，室溫放置5 min，12 000 r/min離心2 min，以提高DNA收率。

1.2.2.3 PCR擴增體系及擴增反應程序。PCR擴增體系為rbcl正向引物及反向引物各1 μL，DNA模板4 μL，蒸餾水19 μL，DNA聚合酶25 μL。擴增反應程序為預變性溫度94 ℃，時間120 s；變性溫度98 ℃，時間10 s；退火溫度55 ℃；延伸溫度72 ℃，時間30 s；以上程序進行40個循環；最后延伸溫度為72 ℃，時間為300 s；最終保存溫度為4 ℃。

1.2.2.4 電泳檢測。上樣量：PCR產物 5 μL；Marker 3 μL。電泳條件：100 V，400 mA，30 min。

1.2.2.5 測序及分析。PCR樣品送樣30 μL，正向引物rbcLa-F送樣15 μL，交由深圳華大基因科技有限公司進行測序。測序結果使用GeneBank進行在線Blast。

2 結果與分析

2.1 基源鑒別

大藤本，有時呈大灌木或小喬木狀，小枝呈螺旋狀或鉤狀。羽狀復葉，葉軸被微柔毛；小葉13～25片，近革質，長圓形或橢圓狀長圓形，先端微凹或鈍，葉表面具銹色稀疏毛，背面毛多，密集于中脈。葉干后背面粉白，邊緣反卷，多角形脈島細小且清晰。聚傘花序頂生或生于上部葉腋，花序梗與花梗被微柔毛?；ㄉ悦芗“研?，花萼鐘狀，花冠白色，旗瓣闊倒卵狀長圓形，先端稍凹缺，基部具闊短瓣柄，翼瓣狹倒卵狀長圓形，無耳，龍骨瓣近半月形，內側具耳，與翼瓣同具狹長瓣柄。雄蕊9，子房無毛或被微柔毛，花柱短。莢果薄革質，長圓形或橢圓形，種子部分具明顯網紋，種子多數1粒，少見2～3粒，腎形（圖1）。花期4—5月。

2.2 性狀鑒別

香材外皮脫落，木部呈圓柱形、扁塊狀或不規則塊狀，表面呈黃棕色、紅棕色至棕黑色，有時殘留條形或塊狀黃白色木部，形成深淺不一的花紋，偶見棕黑色發亮樹脂斑及長圓形凹窩（香眼），土埋者棕色或褐色，通體附著紅色細粉。木質堅硬致密，斷面具同心環狀或輻射狀黃棕、紅棕、棕褐色等花紋，偶見中空（圖2）。氣芳香，味微苦辛、微澀，回甘，火燒冒黑煙，滲油，香氣四溢。

2.3 PCR擴增結果

龍肝香（杠香）PCR擴增出單一清晰的目標條帶（如圖3所示，rbcL序列約為600 bp），表明PCR體系及擴增條件對模板DNA擴增效果理想，特異性高，適用于該試驗龍肝香（杠香）模板DNA的PCR擴增研究。

2.4 測序結果與分析

龍肝香（杠香）rbcl基因序列經深圳華大基因科技有限公司測序分析，所得rbcl序列為：CGAC

CGTAATTCTTAGCGGATAACCCCAATTTCGGTTTAATAGTAC

ATCCCAATAGGGGACGGCCATACTTGTTTAATTTATCTCTTT

CAACTTGGATACCGTGAGGCGGACCTTGGAAAGTTTTAACA

TAAGAAGTAGGGATTCGCAAATCTTCCAGACGTAGGGCGCG

CAGGGCCTTGAACCCAAATACATTACCTACAATGGAAGTAA

ACATGTTAGTAACAGAACCTTCTTCAAAAAGGTCTAAGGGA

TAAGCTACATAAGCAATATATTGATTTTCTTCTCCAGCAACG

GGCTCGATGTTGTAGCATCGTCCTTTGTAACGATCAAGACT

GGTAAGCCCATCGGTCCAAACGGTTGTCCATGTACCAGTAG

AAGATTCGGCAGCTACCGCGGCACCCGCTTCTTCAGGAGGA

ACTCCAGGTTGAGGAGTTACTCGGAATGCGGCCAAGATATC

AGTATCTTTCGTTTCATAGTCAGGAGTATAATAATTCAATTT

ATAATCTTTAACACCAGCTTTGAACCCAACACTTGCTTTAGT

CTCTGTTGGGGGGGAGCCTATA。

上述rbcl序列的在線Blast結果與GeneBank中滇黔黃檀（Dalbergia yunnanensis Franch.）rbcl序列的相似度為100%，E值為0。滇黔黃檀rbcl序列GeneBank登陸號為KM458233.1。近年來，DNA分子鑒定被廣泛應用于中藥材動植物基源的鑒定[1-7]，具有較高的專一性和科學性。陳士林[8]研究得出，GeneBank在線匹配結果相似性高于95%時，可判斷為同源。上述樣品的rbcl序列與GeneBank中滇黔黃檀相似度為100%，表明樣品為豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.）。

3 結論與討論

該試驗與在線Blast結果匹配時，除與滇黔黃檀的相似度為100%外，與多裂黃檀和印度黃檀匹配度亦較高，但印度黃檀為喬木，可予排除，鑒于龍肝香（杠香）原植物與多裂黃檀藤本植物形態差異較大（前者為大藤本，小葉數目13～25對，后者為藤本，小葉數目2～4對），故結合植物形態、香材外觀性狀特征及DNA條形碼特征，可判定龍肝香（杠香）原植物為豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.）?，F版《中國植物志》[9]收載了滇黔黃檀（原變種）（D.yunnanensis Franch.）及其變種高原黃檀（D.yunnanensis var.collettii），經黃檀屬植物學家李世晉等[10]實地考察證明兩者實為同一物種在不同生態環境下的不同形態，并將兩者進行歸并，統稱為滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.），且新的英文版中國植物志（Flora of China）亦將高原黃檀歸并為滇黔黃檀，故滇黔黃檀不再有原變種后綴說明。

滇黔黃檀藥香兩用歷史已久，在多部地方史料中均有記載。其中《西昌中草藥》[11]記載“杠香”為西昌地區常用中草藥，其基源為蝶形花亞科黃檀屬植物云南黃檀（D.yunnanensis Franch.），說明“杠香”早期的原植物名與現今原植物名滇黔黃檀有異，但拉丁學名一致，因此“杠香”與龍肝香實為同物異名。

龍肝香（杠香）來源于豆科蝶形花亞科黃檀屬植物滇黔黃檀（D.yunnanensis Franch.）富含樹脂的木質藤莖，為云川貴少數民族習用香藥，該研究對其進行的原植物品種鑒定為藥用新資源滇黔黃檀的開發奠定了基礎。

龍肝香（杠香）具有較高的香藥兩用經濟價值和應用前景，尤其是其藥用歷史悠久，因此云貴川龍肝香（杠香）作為當地香料和未來藥用資源，應給予合理的開發和應用，其所含的化學成分及藥效作用物質基礎有待今后進一步研究。

參考文獻

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