黃酮類物質的生物合成及對干旱脅迫響應的研究進展

白禹 卯丹 王繼玥

摘要 通過闡述黃酮類物質生物合成、代謝調控以及參與干旱脅迫響應的研究進展，提出了從多組學層面聯合分析逆境脅迫下基因轉錄以及轉錄調控過程，這將有助于深入理解植物對逆境脅迫響應的分子機制，從而為品種改良和產品開發提供理論參考。

關鍵詞 黃酮類物質；生物合成；代謝調控；干旱脅迫響應

中圖分類號 Q945文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0024-03

Abstract The research progress on flavonoids biosynthesis， metabolism regulation and the response to drought stress were summarized， and a joint analysis of multiomics levels to study gene transcription and transcriptional regulation under stress was proposed ， which will help deeper understanding of plant diversity.It aims to provide a theoretical reference for breed improvement and product development.

Key words Flavonoids；Biosynthesis；Metabolism regulation；Response to drought stress

黃酮類物質廣泛存在于植物各器官中，參與花、果實和種子顏色的形成，保護植物抵御紫外線傷害和防止病原微生物侵襲。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、防治血管硬化、降低心肌耗氧量、抗衰老、增強機體免疫力等功能，現已廣泛應用于醫藥和食品行業，具有較高的經濟價值[1]。近年來，隨著類黃酮醫療保健功能的逐步闡釋，以及合成生物學的興起，掀起了一股研究類黃酮代謝途徑和調控機理的熱潮。

植物次生代謝物在種屬間的差異與其環境選擇高度相關，外界環境可誘導植物體內次生代謝產物的合成、積累以及轉運。其中，水分對植物體內次生代謝的影響尤為重要，與各類有效成分含量密切相關[2]。大量研究證實植物體內類黃酮含量與其抗逆性直接相關，增加植物類黃酮的含量能增強植物抵御干旱、寒冷、高鹽等逆境脅迫的能力[1-4]。分析黃酮類物質在環境脅迫下的積累模式和變化規律，將有利于解析其生物合成的調控途徑，從而為品種改良和產品開發提供理論參考。筆者概述了黃酮類物質的生物合成以及對干旱脅迫響應的研究進展，為進一步研究黃酮類物質的應用提供基礎生物學資料。

1 黃酮類化合物的生物合成與代謝調控

Gul等[3]分析認為，黃秋葵具有的抗氧化、清除自由基、抑菌和抑制細胞增生的作用，可能主要與其富含黃酮多酚類物質有關。黃酮類化合物是植物在長期進化中為抵御惡劣的生存環境、動物和微生物等侵襲而形成的一大類次生代謝產物，在多種植物的根、莖、葉、花、果中均有分布，其成分主要為黃酮醇、黃酮、異黃酮和花色素苷等。黃酮類化合物的藥效成分包括大豆異黃酮、黃芩黃酮、槲皮素、淫羊藿苷、水飛薊素等，具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力、抗癌等作用[1-2]。黃酮類化合物在植物體內中具有組織、發育和環境因子特異性，參與防御生物與非生物脅迫、生殖過程的信號轉導等過程。在植物遭受干旱、高溫、輻射等非生物脅迫時，通過合成黃酮類化合物來消耗過剩的磷酸丙糖、ATP和NADPH，形成能量安全閥，以減輕非生物脅迫所造成的損傷[1-2]。最近，Wen等[4]基于全基因組關聯的代謝組學，分析了玉米酰基化胍丁胺、酰基化腐胺、色胺、黃酮等物質的代謝途徑與遺傳機理，這為研究植物次生代謝產物合成的分子機理提供了新的思路和方法。

1.1 生物合成

代謝組學研究表明植物次生代謝產物的合成總是在變化，正如遺傳多樣性造成不同品種和生態型的代謝表型存在數量和性質的差異[5]。雖然對植物次生代謝進行了大量的研究，但只有黃酮類化合物的生物合成途徑是較為清晰的，其中許多關鍵酶已經克隆，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（CA4H）和4-香豆酸CoA的連接酶（4CL）等。黃酮類化合物的生物合成主要是通過苯丙烷代謝途徑來實現的[6]。起始底物4-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA在查爾酮合成酶（CHS）的作用下形成查耳酮，再由查耳酮異構酶催化查耳酮生成4，5，7-三羥黃烷酮，作為代謝的主要產物再進入其他不同的代謝途徑，進而形成不同的黃酮類物質。CHS是苯丙烷系代謝途徑中含量較豐富的酶之一，該酶在植物體內的轉錄受到高濃度肉桂酸的抑制，但高濃度的香豆酸可以促進其表達[2]。查爾酮異構酶（CHI）是植物黃酮類代謝途徑上游的關鍵酶，決定黃酮醇的合成。黃酮醇合成酶（FH3）是黃烷酮分支途徑的核心酶，通過催化黃烷酮類底物生成二氫山奈素（DHK），進而影響黃酮醇和花色素的合成，是類黃酮代謝途徑的中樞。黃酮醇合成酶（FLS）催化二氫黃酮醇分別生成山奈素、楊梅素和棚皮素等黃酮醇。而二氫黃酮醇還原酶（DFR）主要是將二氫黃酮醇催化生成無色天竺葵素、無色矢車菊素和無色翠雀素等無色花色素。研究表明，FLS和DFR競爭二氫黃酮醇底物，在矮牽牛、康乃馨和紫羅蘭的無色花中，FLS的活性比較高，但在花青素開始合成時，FLS的活性明顯降低[7]。說明植物可通過抑制黃酮醇的合成來促進花青素的合成，或者抑制花青素的合成以提高黃酮醇的含量。花色素合成酶（ANS）是植物類黃酮生物合成中后期表達的關鍵酶，主要催化無色的原花色素氧化產生有色的花色素，已在多種植物中克隆了ANS相關基因[8]。揭示編碼這些關鍵酶的基因功能對于理解植物黃酮類化合物的代謝通路及其調控機制具有重要的意義。

黃酮類化合物通常以糖苷或其他共軛體的形式存在，通過細胞內的特殊載體蛋白，運輸到液泡中累積[5]。植物花粉中也含有黃酮類化合物，鳳仙花葉綠體中黃酮類化合物的含量高達2%。黃酮類化合物在植物體內分布不均勻，往往集中于某些特定的組織或器官中。慈竹葉中的總黃酮含量顯著大于枝和桿中，分別是枝的4.30倍、桿的11.35倍[9]。大豆萌芽后5 d時，幼苗的根部組織、胚軸以及子葉中都是以異黃酮為主要成分，而初生的葉片組織中則以糖基黃酮醇類為主[5]。黃酮類化合物含量的器官差異可能與植物器官所承擔的功能有關，而其組織特異性可能與代謝相關酶的分布、含量以及活性的組織差異性有關[9]。黃酮類化合物的組織和器官特異性對于藥用植物的栽培育種具有重要的意義。通過栽培條件的優化選擇，在確保植物正常生長的前提下，使特定組織或器官中黃酮類化合物累積，適時的采收，從而顯著提高藥用植物的利用效率。

1.2 代謝調控

研究表明，編碼類黃酮合成相關酶基因（CHS、FLS、FH3、DFR、ANS）的表達會受到MYB、MYC、bZIP 蛋白、WD40蛋白和鋅指蛋白等轉錄因子的調控。這些轉錄因子通過結合類黃酮生物合成關鍵酶基因啟動子中的順式作用元件，進而影響相應基因的表達，從而實現對類黃酮生物合成的調控。目前已在擬南芥、玉米、矮牽牛、梨、蘋果、葡萄、煙草[10-11]等植物中克隆了與類黃酮生物合成相關的調控基因。

2R-MYB轉錄因子廣泛參與植物苯丙烷代謝途徑[12-13]，對類黃酮的生物合成有重要的調控作用[14]。杜海等[15]研究表明，大豆Gm MYB042 基因的表達受干旱、高鹽、低溫和 UV-B 脅迫的誘導，該基因參與調控植物對逆境脅迫的應答過程；該基因參與類黃酮生物合成的調控，其C端保守氨基酸基序和鋅指結構對其功能具有轉錄抑制作用，可以影響類黃酮的代謝合成。許鋒等[16]研究表明，銀杏葉中黃酮類物質的積累與 CHS基因的轉錄水平相關，提示CHS基因可能在黃酮類物質代謝過程發揮關鍵的調節作用。王旭等[17]首次在黃秋葵中克隆到查爾酮合成酶基因（CHS），序列分析表明，其推斷的氨基酸序列含有CHS 蛋白的標簽序列GFGPG以及4個保守活性位點Cys164、Phe215、His303、Asn336，黃秋葵果實、花、葉片中均有該基因的表達，但在整個生育期中都是花中表達量最高。Mehrtens等[18]研究表明，擬南芥FLS基因的表達受R2R3型MYB轉錄因子的調控，AtMYB11、AtMYB12、AtMYB111分別在擬南芥不同的組織中表達。韋康等[19]利用數字表達譜技術發現茶樹花瓣、休眠芽、萌發芽中大量表達類黃酮合成途徑相關基因，在MYB、bHLH、MADS、GST、WD40、Homeodomain基因家族中找到12個基因可能參與花瓣中類黃酮生物合成的調控，9個基因可能參與芽中類黃酮生物合成的調控。

在調控類黃酮生物合成中，一些轉錄因子可通過與其他蛋白的相互作用來共同激活結構基因的轉錄。玉米C1轉錄因子與bHLH 蛋白互作，共同激活DFR 基因和 3GT 基因，可調控花青素的合成。Huang等[20]從淫羊霍中分離到一個新MYB轉錄因子——EsAN2，可與4個bHLH 蛋白互作調控花青素的合成。Zimmermann[21]等研究發現，擬南芥 MYB 蛋白 R3 重復區域有一段保守的信號（[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R），是MYB 和 bHLH 蛋白互作的結構基序，可借此預測MYB蛋白和bHLH蛋白的互作。在矮牽牛、擬南芥等一些植物中還存在著MYB、bHLH和WD40這3 種蛋白以MYB-bHLH-WD40（MBW）三元復合體模式參與類黃酮生物合成的調控[22]。在擬南芥中發現至少有4種MBW復合體參與調控種皮中原花色素的積累，其中TT2-TT8- TTG1 主要調控花青素下游合成途徑中關鍵酶基因的表達，而TT2-EGL3、GL3-TTG1 復合體負責調控花青素還原酶基因的表達[23]。

2 黃酮類物質對干旱脅迫的響應

干旱、高鹽等非生物脅迫會使植物產生大量活性氧，從而誘導合成黃酮類化合物以避免細胞氧化損傷。黃酮類化合物還可以與銅等金屬離子結合，從而降低金屬離子對胞質結構的破壞。因此，植物通過調節體內抗氧化物質含量來抵抗干旱脅迫。Song等[24]克隆了枸杞中LcF3H基因，轉基因試驗顯示LcF3H基因可通過增強煙草的抗氧化能力而增加其抗干旱脅迫的能力。

目前，有關干旱脅迫對植物黃酮類物質含量影響的研究結果不盡相同[25-27]。孫坤等[26]研究發現，隨干旱脅迫程度增強，沙棘葉片總黃酮含量呈現先下降后上升的趨勢，其與PAL、C4H和4CL酶活性呈負相關。王改利等[27]研究表明，適宜的干旱脅迫可促進酸棗葉片中黃酮類物質的合成。而汪貴斌等[25]研究表明，土壤水分對銀杏葉中黃酮類化合物積累的影響不顯著。雖然黃秋葵比一般蔬菜耐旱、耐高溫，但在嚴重高溫和干旱條件下其出苗率、植株的生長發育以及開花等過程都受到抑制，進而影響莢果發育過程，降低結實率，導致減產[27]。這些研究結果提示黃秋葵對水分脅迫可能存在一定的耐受范圍，不同生長和發育期以及不同組織和器官對水分的需求不同，因此對不同程度的水分脅迫的響應也存在差異。而通過添加水楊酸和抗壞血酸，能顯著緩解干旱脅迫對黃秋葵種子萌發和幼苗生長的危害[28]。

3 基因表達與環境脅迫

細胞活動是連續的動態過程，基因轉錄是其最顯著的活動之一。嵌在轉錄中的遺傳信息被翻譯成蛋白質以參與特定的代謝反應，而一些沒有翻譯的轉錄本，則參與轉錄和轉錄后水平的調控[29-30]。因此，研究基因表達調控對于理解細胞內各種代謝活動至關重要。在逆境條件下細胞可通過抑制轉錄減少某些有害物質在細胞內的累積，同時也會激活相應抗性基因的表達，合成不同的次生代謝產物，以抵抗逆境脅迫[31]。目前，大量研究集中于逆境脅迫下的轉錄機制研究，通過生物技術手段調控植物次生代謝過程，以及培育抗逆境脅迫植物等方面。Bhardwaj等[32]利用RNA-seq技術獲取了油菜幼苗干旱和高溫脅迫下的全基因組表達譜，發現大量轉錄因子下調表達，這些轉錄因子主要分屬于熱激蛋白（hsf）和脫水反應應答元件（含有DREB）家族。侯伶俐等[33]研究發現，在干旱、NaCl、UV-B脅迫下苦蕎的根、莖、葉、花中總黃酮含量均顯著升高，且與CHI、F3H、FLS、FLS1 基因表達量的變化趨勢相一致。Matsuda等[34]基于代謝組學分析指出，水稻黃酮苷結構的多樣性主要是由于芹黃素等不同配基的修飾產生的。

4 展望

由于植物抗性受多基因多層次調節控制，因此，從多組學層面研究逆境脅迫下基因轉錄以及轉錄調控過程，將有助于深入理解植物對逆境脅迫響應的分子機制。今后，可利用多組學技術聯合分析植物在干旱脅迫下類黃酮等次生代謝產物的遺傳、代謝以及表達調控機制，從而為植物品種改良、植物藥用成分的開發利用提供參考。

參考文獻

[1] 秦曉曉.蘋果屬觀賞海棠類黃酮種類、代謝及生物活性分析[D].重慶：西南大學，2016.

[2] 諸姮，胡宏友，盧昌義，等.植物體內的黃酮類化合物代謝及其調控研究進展[J].廈門大學學報（自然科學版），2007， 46（S1）：136-143.

[3] GUL M Z，BHAKSHU L M，AHMAD F.Evaluation of Abelmoschus moschatus extracts for antioxidant， free radical scavenging， antimicrobial and antiproliferative activities using in vitro assays[J].BMC Complementary and Alternative Medicine，2011，38（11）： 1-12.

[4] WEN W W，LI D LI X，et al.Metabolomebased genomewide association study of maize kernel leads to novel biochemical insights[J].Science foundation in China， 2015，5（2）：32.

[5] CARRENOQUINTERO N，BOUWMEESTER H J，KEURENTJES J J B.Genetic analysis of metabolomephenotype interactions：From model to crop species[J].Trends in genetics，2013，29（1）：41-50.

[6] MIERZIAK J，KOSTYN K，KULMA A.Flavonoids as important molecules of plant interactions with the environment[J].Molecules，2014，19（10）：16240-16265.

[7] NAKATSUKA A，MIZUTA D，KII Y，et al.Isolation and expression analysis of flavonoid biosynthesis genes in evergreen azalea[J].Scientia horticulturae，2008， 118（4）：314-320.

[8] 晏校.逆境脅迫對枳實生苗類黃酮組分含量及關鍵酶基因表達量的影響[D].武漢：華中農業大學，2011.

[9] DOXIN R A，PAIVA N L.Stressinduced phenylpropanoid metabolism[J].Plant cell，1995，7（7）：1085-1097.

[10] ZHANG W，NING G G，LV H Y，et al.Single MYBtype transcription factor AtCAPRICE：A new efficient tool to engineer the production of anthocyanin in tobacco[J].Biochemical and biophysical research communications，2009，388（4）：742-747.

[11] PATTANAIK S，KONG Q，ZAITLIN D，et al.Isolation and functional characterization of a floral tissuespecific R2R3 MYB regulator from tobacco[J].Planta，2010，231（5）：1061-1076.

[12] LEGAY S，SIVADON P，BLERVACQ A S，et al.EgMYB1，an R2R3 MYB transcription factor from eucalyptus negatively regulates secondary cell wall formation in Arabidopsis and poplar[J].New phytologist，2010，188（3）： 774-786.

[13] SONBOL F M，FORNAL S，CAPELLADES M，et al.The maize Zm MYB42 represses the phenylpropanoid pathway and affects the cell wall structure， composition and degradability in Arabidopsis thaliana[J].Plant molecular biology，2009，70（2）：283-296.

[14] STRACKE R，ISHIHARA H，HUEP G，et al.Differential regulation of closely related R2R3MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of the Arabidopsis thaliana seedling[J].The plant journal，2007，50（1）：660-677.

[15] 杜海，冉鳳，馬珊珊，等.GmMYB042基因對類黃酮生物合成的調控作用[J].作物學報，2016，42（1）：1-10.

[16] 許鋒，程水源，程述漢，等.銀杏查爾酮合成酶基因表達的時間進程[J].植物生理與分子生物學學報，2007，33（4）： 309-317.

[17] 王旭，韓春樂，周亞楠，等.黃秋葵查爾酮合成酶基因AeCHS的克隆與表達分析[J].植物遺傳資源學報，2014，15（3）： 561-567.

[18] MEHRTENS F，KRANZ H，BEDNAREK P，et al.The Arabidopsis transcription factor MYB12 is a flavonolspecific regulator of phenylpropanoid biosynthesis[J].Plant physiology，2005，138（2）：1083-1096.

[19] 韋康，王麗鴛，成浩，等.基于數字表達譜對茶樹類黃酮合成、調控相關基因表達的研究[J].茶葉科學，2014， 34（2）：195-203.

[20] HUANG W J，KHALDUN A B M，LV H Y，et al.Isolation and functional characterization of a R2R3MYB regulator of the anthocyanin biosynthetic pathway from Epimedium sagittatum[J].Plant cell reports，2016，35（4）：883-894.

[21] ZIMMERMANN I M，HEIM M A，WEISSHAAR B，et al.Comprehensive identification of Arabidopsis thaliana MYB transcription factors interacting with R/Blike BHLH proteins[J].The plant journal，2004，40（1）：22-34.

[22] VIOLA I L，CAMOIRANO A ，GONZALEZ D H.Redoxdependent modulation of anthocyanin biosynthesis by the TCP transcription factor TCP15 during exposure to high light intensity conditions in Arabidopsis[J].Plant physiology，2015，170（1）：74-85.

[23] XU W J，DUBOS C，LEPINIEC L.Transcriptional control of flavonoid biosynthesis by MYBbHLHWDR complexes[J].Trends in plant science，2015，20（3）：176-185.

[24] SONG X J，DIAO J J，JI J，et al.Molecular cloning and identification of a flavanone 3hydroxylase gene from Lycium chinense，and its overexpression enhances drought stress in tobacco[J].Plant physiology and biochemistry，2016，98（1）：89-100.

[25] 汪貴斌，郭旭琴，常麗，等.溫度和土壤水分對銀杏葉黃酮類化合物積累的影響[J].應用生態學報，2013，24（11）： 3077-3083.

[26] 孫坤，張宏濤，陳紋，等.干旱脅迫對肋果沙棘（Hippop hae neurocarpa）試管苗葉片黃酮類化合物代謝的影響[J].西北師范大學學報（自然科學版），2015，51（3）：72-78.

[27] 王改利，魏忠，賀少軒，等.土壤干旱脅迫對酸棗葉片黃酮類代謝及某些生長和生理指標的影響[J].植物資源與環境學報，2011，20（3）：1-8.

[28] BAGHIZADEH A，HAJMOHAMMADREZAEI M.Effect of drought stress and its interaction with ascorbate and salicylic acid on okra （Hibiscus esculents L.） germination and seedling growth[J].Journal of stress physiology & biochemistry，2011，7（1）：55-65.

[29] DING Y F，TAO Y L，ZHU C.Emerging roles of microRNAs in the mediation of drought stress response in plants[J].Journal of experimental botany，2013， 64（11）：3077-3086.

[30] SUNKAR R，LI Y F，JAGADEESWARAN G，et al.Functions of microRNAs in plant stress responses[J].Trends in plant science，2012，17（4）：196-203.

[31] SAITO K.Phytochemical genomics：A new trend[J].Current opinion in plant biology，2013，16（3）： 373-380.

[32] BHARDWAJ A R，JOSHI G，KUKREJA B，et al.Global insights into high temperature and drought stress regulated genes by RNASeq in economically important oilseed crop Brassica juncea[J].BMC Plant Biology， 2015，15： 1-15.

[33] 侯伶俐，楊雄榜，董雪妮，等.逆境脅迫對苦蕎花期總黃酮含量及關鍵酶基因表達的影響[J].核農學報，2016，30（1）： 184-192.

[34] MATSUDA F，NAKABAYASHI R，YANG Z G，et al.Metabolomegenomewide association study dissects genetic architecture for generating natural variation in rice secondary metabolism[J].The plant journal，2015，81（1）：13-23.