沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

陳錦玲 徐媛 陳玉梅 李璐璐 李惠敏 秦新民

摘要 [目的] 研究沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)序列所包含的生物信息學(xué)。[方法] 利用高通量測(cè)序?qū)ι程镨肿越缓彤惤换ㄖM(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)差異分析得到沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因序列。采用生物信息學(xué)方法，對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)從序列特征、理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)以及功能域等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。[結(jié)果] 該基因全長(zhǎng)為2 323 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)為1 560 bp（Genbank登錄號(hào)：MG925820），共編碼519個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為57.39 kD，等電點(diǎn)PI為8.55。該蛋白質(zhì)含有1個(gè)植物STKc IRAK蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，為親水性穩(wěn)定蛋白。氨基酸序列分析表明，其編碼的氨基酸與克萊門(mén)柚和甜橙的同源性分別為 100%、99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因與克萊門(mén)柚和甜橙親緣關(guān)系很近，屬于同一進(jìn)化分支。[結(jié)論] 該研究結(jié)果可為今后深入研究沙田柚自交不親和機(jī)理提供參考。

關(guān)鍵詞 沙田柚；類(lèi)蛋白激酶基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào) S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）16-0088-05

Abstract [Objective]To study the biological information contained in the protein sequence encoded receptorlike protein kinases gene.[Method]The transcriptome of the selfpollinated style and crosspollinated style of Citrus grandis var.Shatinyu Hort were sequenced by highthroughput sequencing technology.Receptorlike protein kinases gene sequence of C.grandis var.Shatinyu Hort was obtained though differential analysis method， and some characters of the receptorlike protein kinases protein were analyzed and predicted by bioinformatics method， including the composition of amino acid sequence， physicochemical parameters， hydrophobicity， transmembrane domain， secondary structure and function of protein，etc. [Result] Receptorlike protein kinases gene was 2 323 bp in length with an open reading frame （ORF） of 1 560 bp， encoding 519 amino acids with deduced molecular weight of 57.39 kD， and theoretical pI value of 8.55， and contained a STKc IRAK domain.Bioinformatics analysis showed that receptorlike protein kinases protein was a hydrophobic and stable protein.The homology analysis of amino acid sequence indicated that the receptorlike protein kinases protein shared high homology with that of Citrus clementina （100%） and Citrus sinensis （99%）.Phylogentic analysis revealed that receptorlike protein kinases gene showed closer kinship with that of C.clementina and C.sinensis，indicating that they belong to the same evolutionary branch.[Conclution]The results could provide a theoretical reference for further study of selfincompatibility molecular mechanism in C.grandis var.Shatinyu Hort.

Key words Citrus grandis var.Shatinyu Hort；Receptorlike protein kinases gene；Bioinformatics

沙田柚（Citrus grandis var.Shatinyu Hort）隸屬于蕓香科柑橘屬，具有配子體自交不親和的特性。植物自交不親和（selfincompatibility， SI）是指具有完全花且能夠產(chǎn)生雌雄配子，雌蕊的柱頭或花柱能特異性識(shí)別與自體基因型相同的花粉，導(dǎo)致花粉不萌發(fā)或花粉管停止生長(zhǎng)的一種現(xiàn)象[1]。這種現(xiàn)象在避免植物近親繁殖方面具有重要的意義。目前，關(guān)于蕓香科植物的自交不親和性機(jī)理尚不明確，但在沙田柚自交不親和的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)等方面的研究已取得了一定進(jìn)展[2]。秦新民等[3]分離并鑒定了沙田柚花粉管特異蛋白；楊繼華等[4-5]利用IEF/SDS-PAGESHUA雙向電泳的方法測(cè)定了沙田柚自交花柱特異蛋白的分子量、等電點(diǎn)以及N-末端氨基酸序列；薛妙男等[6-7]確定了沙田柚自交花粉管在花柱中生長(zhǎng)的受阻部位；秦新民等[8-9]還確定了花柱通道細(xì)胞中特異蛋白和花粉管中特異蛋白的產(chǎn)生部位及分布。

植物中的類(lèi)蛋白激酶通過(guò)磷酸化和去磷酸化作用調(diào)節(jié)植物的代謝，這些過(guò)程幾乎涉及所有的生理和病理過(guò)程[10]，主要作用于植物的細(xì)胞抗逆反應(yīng)[11] 、生長(zhǎng)發(fā)育[12-13] 、抗病防衛(wèi)[14-15] 、自交不親和[16]以及胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]等方面。筆者通過(guò)對(duì)沙田柚自交和異交花柱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因，并對(duì)該基因編碼的蛋白質(zhì)理化特征和基因表達(dá)進(jìn)行了分析，旨在為深入研究沙田柚自交不親和的分子機(jī)理提供分子理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為廣西靈川縣潮田鄉(xiāng)大山口村果園內(nèi)10年生的沙田柚果樹(shù)花柱，分別采集使用人工自交（沙田柚×沙田柚）和異交（酸柚×沙田柚）方式授粉后1～3 d的花柱，立即放置于液氮中，隨后存放到超低溫冰箱（-80 ℃）中備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取。根據(jù)改良的 Trizol 法對(duì)植物總 RNA 進(jìn)行提取[18]。

1.2.2 測(cè)序。通過(guò)檢測(cè)選擇合格RNA送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序。 用 Illumina HiSeqTM 2000 對(duì)制備好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 序列分析和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

將得到的測(cè)序結(jié)果序列在NCBI的Blast程序上進(jìn)行基因序列的同源性比較分析；并利用DNAman、Finder、TMpred、Swissmodel、NetPhos2.0等軟件進(jìn)行序列和蛋白質(zhì)理化分析；在GenBank上下載與該序列同源性相近的其他物種的序列，用DNAman軟件對(duì)類(lèi)蛋白激酶基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的生物信息學(xué)分析

沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因（Unigene10208_All）序列全長(zhǎng)2 323 bp（GenBank登錄號(hào)：MG925820），在NCBI在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行比對(duì)，尋找該基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），用DNAman軟件對(duì)該基因進(jìn)行翻譯，結(jié)果顯示：該序列有1個(gè)1 560 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼的蛋白質(zhì)含519個(gè)氨基酸（圖1）。

2.2 編碼蛋白質(zhì)的分析和疏水性預(yù)測(cè)

將類(lèi)蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)序列放入理化性質(zhì)在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http：//web.expasy.org/protparam/）中進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示：該基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2569H4044N698O745S24，分子質(zhì)量為57.39 kD，等電點(diǎn)PI為8.55。構(gòu)成該蛋白質(zhì)的氨基酸中，亮氨酸（Leu）所占比例最大，達(dá)13.7%，組氨酸（His）所占比例最少，僅為1.5%。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為33.94（<40），表明該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白。其中，該蛋白質(zhì)攜帶的負(fù)電荷氨基酸（Asp + Glu）總數(shù)為 52，正電荷氨基酸（Arg + Lys）總數(shù)為58。利用DNAman軟件對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，該基因編碼的肽鏈中疏水性最大值約為3.48，位于第141位氨基酸，最小值約為-3.71，位于第172位氨基酸。該蛋白質(zhì)疏水性平均值為-0.12，鑒定該蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

2.3 跨膜預(yù)測(cè) 運(yùn)用跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù) TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)沙田柚類(lèi)蛋白激酶跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)屬于跨膜蛋白，其中1～141位部分位于膜外，142～164位部分跨膜，165～519位部分位于膜內(nèi)（圖3）。

2.4 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)采用在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，類(lèi)蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)共有39個(gè)可能的磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)共有26個(gè)，分別位于蛋白質(zhì)的第4、23、53、77、85、94、107、135、183、191、200、220、244、297、298、303、370、371、374、375、398、442、443、446、483、493位；蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)共有9個(gè)，分別位于蛋白質(zhì)的第68、103、230、232、234、235、253、300和415位；酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)僅4個(gè)，分別位于蛋白質(zhì)的第236、386、391、404位。

可知此蛋白質(zhì)的磷酸化以絲氨酸磷酸化為主，其次為蘇氨酸和酪氨酸。

2.5 功能結(jié)構(gòu)域分析

將編碼的氨基酸序列用NCBI上的Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有1個(gè)與STKc IRAK蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域，屬于PKc like超家族，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。

2.6 蛋白質(zhì)二級(jí)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

運(yùn)用在線(xiàn)分析軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）對(duì)類(lèi)蛋白酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，在該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中， α-螺旋所占比例為38.54%，延伸鏈13.29%，無(wú)規(guī)則卷曲48.17%，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5所示。

利用在線(xiàn)軟件Phyre2 [19]對(duì)RING Finger蛋白氨基酸序列三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。

2.7 同源性分析

從NCBI上下載其他9種植物的類(lèi)蛋白激酶基因編碼的氨基酸序列，利用DNAman構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)與蕓香科的克萊門(mén)柚（Citrus clementina）和甜橙（Citrus sinensis）的類(lèi)蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)相似性很高，相似度約為100%和99%。該同源樹(shù)顯示該物種與克萊門(mén)柚和甜橙親緣關(guān)系很近，屬于同一分支（圖7）。

2.8 類(lèi)蛋白激酶基因在沙田柚自交和異交花柱中的表達(dá)

該研究克隆的類(lèi)蛋白激酶在沙田柚自交花柱和異交花柱中的表達(dá)有較為明顯的差異：在未授粉花柱中其表達(dá)量（reads per kb per million reads，RPKM） [20]為 0.01，自交1 d花柱中的表達(dá)量上升至1.61，自交2 d花柱中的表達(dá)量繼續(xù)上升至5.97，自交3 d的其表達(dá)量上升至6.23。而在異交1 d花柱中的表達(dá)量上升至4.06，異交2 d花柱中的表達(dá)量繼續(xù)上升至6.41，但異交3 d花柱中的表達(dá)量迅速下降至1.81。從上述結(jié)果可以看出無(wú)論自交授粉還是異交授粉，第1天花柱中類(lèi)蛋白激酶基因的表達(dá)都表現(xiàn)為迅速升高，利用 RPKM對(duì)該基因在自交和異交花柱中的表達(dá)水平進(jìn)行估算，設(shè)定錯(cuò)誤檢測(cè)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.001 且差異倍數(shù) ≥2 倍的基因視作顯著差異表達(dá)基因， 以 RPKM 值取 2 的對(duì)數(shù)值（log2）對(duì)自交1 d/異交 1 d、自交2 d/異交2 d，以及自交3 d/異交3 d花柱中類(lèi)蛋白激酶基因的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其數(shù)值分別為-1.33、-0.10、1.78。

3 討論

蛋白激酶是一類(lèi)催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，能將腺苷三磷酸（ATP）上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基上[21]。類(lèi)蛋白激酶蛋白的磷酸化以絲氨酸磷酸化為主，其次為蘇氨酸和酪氨酸，且與STKc IRAK蛋白有相同的保守結(jié)構(gòu)域，屬于PKc like超家族。該研究通過(guò)序列同源性分析，沙田柚類(lèi)蛋白激酶基因編碼的氨基酸與克萊門(mén)柚（Citrus clementina）和甜橙（Citrus sinensis） 的同源性分別為 100%、99%，表明Unigene10208_All為類(lèi)蛋白激酶基因。

植物蛋白激酶在植物體內(nèi)起著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[17，22-23]。杜秀貞等[10]發(fā)現(xiàn)小麥類(lèi)蛋白激酶基因片段TA50-10可以誘導(dǎo)植物抗病，且具有譜性。蛋白激酶在生長(zhǎng)發(fā)育方面也有顯著的作用。李濤等[24]發(fā)現(xiàn)類(lèi)蛋白激酶基因OsAGWI可以通過(guò)控制水稻穎殼外表皮細(xì)胞以及維管束的發(fā)育來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)籽粒大小的控制。該研究獲得的類(lèi)蛋白激酶基因自交1 d花柱中的表達(dá)量上升至1.61，自交2 d花柱中的表達(dá)量繼續(xù)上升至5.97，自交3 d的表達(dá)量仍上升至6.23。而在異交1 d花柱中的表達(dá)量上升至4.06，異交2 d花柱中的表達(dá)量也繼續(xù)上升至6.41，但異交3 d花柱中的表達(dá)量卻下降至1.81。自交 1 d/異交 1 d、自交3 d/異交3 d花柱的 log2（RPKM ratio）分別為-1.33，1.78，達(dá)到差異表達(dá)的水平。此外，該基因與沙田柚授粉相關(guān)，在未授粉花柱中其表達(dá)量非常低（0.01），自交授粉1 d時(shí)達(dá)1.61，異交授粉1 d也達(dá)4.06。但該基因與沙田柚自交不親和性的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

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