三羥基異黃酮對脂肪酸氧化關鍵酶的調控研究

代子玲 范遠景 楊登玲 徐柳 童金柱 婁鵬翔

摘要 [目的]探討三羥基異黃酮（Genistein， Gen）對非酒精性脂肪肝病（NAFLD）模型中脂肪酸β氧化限速酶肉堿棕桐酰轉移酶1（Carnitine acetyltransferase 1，CPT-1）的調節作用。[方法]油酸誘導細胞建模，實時熒光定量PCR測定三羥基異黃酮處理后細胞中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）和CPT-1的mRNA相對表達量。[結果]Gen能經由PPARs途徑上調CPT-1 mRNA的表達。 [結論]該研究為三羥基異黃酮在臨床藥理上的應用以及非酒精性脂肪肝的預防治療和藥物研究提供了試驗依據。

關鍵詞 三羥基異黃酮；非酒精性脂肪肝病；過氧化物酶體增殖物激活受體α； 肉堿棕桐酰轉移酶

中圖分類號 S188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0097-03

Abstract [Objective]To investigate the regulatory mechanism of Genistein on CPT1， a key ratelimiting enzyme of fatty acids in NAFLD model. [Method]The expression of mRNA PPARα and CPT1 were measured by realtime fluorescence quantitative PCR. [Result] Gen can regulate the mRNA expression of CPT1 through via PPARs pathway. [Conclusion]The study provides a test basis for the application of Genistein in clinical pharmacology and the prevention and treatment of NAFLD.

Key words Genistein；NAFLD；PPARα；CPT1

三羥基異黃酮（Genistein， Gen）是大豆異黃酮的主要活性成分，特有的類似雌激素的化學結構，使其具有多種分子學效應，表現在影響癌變、肥胖、骨質疏松和代謝綜合征等方面，在預防和治療常見疾病方面起著重要作用[1]。相關研究表明Gen能廣泛參與調控人體脂質代謝、脂肪酸代謝等多種生理學活動，對脂質代謝有關的基因進行調控，調節脂肪細胞合成與分化，改善脂質代謝[2]。非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一種由多種因素共同作用產生的慢性肝類疾病，雖無過量飲酒，但伴隨肝細胞變性和脂肪沉積等癥狀[3]，其發病率正在逐年提高，已經引起了國內外的重視[4-5]。研究表明NAFLD在人群中的流行率為20%～30%，且在成人和高工業化的國家中發病率更高[6]。過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisome proliferatorsactivated receptors α，PPARα）、肉堿棕桐酰轉移酶（Carnitine acetyltransferase 1， CPT-1）分別是脂肪酸氧化過程中的關鍵轉錄因子和關鍵限速酶，CPT-1是PPARα的重要下游靶基因[7]。脂肪酸氧化異常是NAFLD的重要發病因素之一，NAFLD作為一種常見的肝病，通常伴隨著游離脂肪酸水平過高、甘油三酯沉積等一系列癥狀[8]。目前，NAFLD對人們的健康有著嚴重威脅，但國際機構迄今尚未批準任何藥物作為治療非酒精性脂肪肝的公開藥品，研制與開發治療非酒精性脂肪肝藥物和治療手段迫在眉睫[9]。筆者研究了Gen對脂肪酸氧化的調控作用，對預防和開發NAFLD藥物具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗細胞。試驗用到的細胞包括人肝癌細胞HepG2、人肝癌細胞Hep3b、人正常肝細胞L-O2、小鼠前脂肪細胞3T3-L1，均購自中國科學院體外典型培養物保存委員會上海細胞庫。

1.1.2 主要儀器。HH.CP-01W型二氧化碳細胞培養箱（上海博遠實業有限公司）；BDS 200型倒置顯微鏡（重慶奧特光學儀器公司）；超凈工作臺（蘇州凈化技術公司）；CT14RD高速冷凍離心機（Beckman Coulter）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）； iQTM5多重實時熒光定量 PCR儀（Bio-Rad 公司）。

1.1.3 主要試劑。三羥基異黃酮（Gen）、非諾貝特（F），購自上海生工；油酸（OA），購自SigmaAldrich；DMEM、RPMI 1640培養基，購自上海普飛生物公司； IBMX、地塞米松、胰島素，購自Cay Chemical；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.4 引物設計。從NCBI上獲取人和小鼠CPT-1、HMGCS1、ACC基因序列，使用IDT（Integrated DNA Technologies）進行引物的設計，利用NCBI/BLAST對引物進行特異性校對。人CPT-1 F： CAGCAAGTGGAGCTGTTTGA，R： TGAGGTTCTCTCCCACAAGG； 小鼠CPT-1 F：GATGTGGACCTGCATTCCTT，R：TCCTTGTAATGTGCGAGCTG；人β-actin F：AGCCATGTACGTAGCCATCCA，R：TCTCCGGAGTCCATCACAATG；小鼠β-actin F：ACGAGGCCCAGAGCAAGAG，R：GGTGTGGTGCCAGATCTTCTC。試驗所用的實時熒光定量PCR引物是由上海生工提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組處理。

1.2.1.1 細胞培養。按照90 mL（DMEM），胎牛血清（FBS）10 mL，青鏈霉素混合溶液1 mL（購自上海生工）比例配制完全培養基。細胞復蘇后，次日換液，當培養瓶底面有70%～85%細胞覆蓋時即進行1∶2傳代。觀察細胞生長狀態，2 d傳代1次，當細胞狀態穩定時，可用于后續試驗。小鼠前脂肪細胞3T3-L1需誘導分化為成熟的脂肪細胞才能進行后續試驗。3T3-L1的成熟誘導分化主要步驟：①取生長狀態良好的對數期3T3-L1接種于細胞板，放于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養箱中培養過夜；②加入分化液I（含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰島素的高糖培養基）于培養箱中培養；③48 h后，換用誘導分化液Ⅱ（含5 mg/L胰島素的高糖培養基）進行培養 ；④每隔48 h換誘導分化液 Ⅱ 1次，12 d左右基本誘導分化為成熟脂肪細胞，可用于后續試驗。

1.2.1.2 細胞分組。將對數期細胞種于12孔板，培養過夜。1 mmo/L油酸誘導24 h后進行加藥處理，試驗分為空白組（Control）；模型組（1 mmol/L OA）； Gen組（0、15、30、60、120 μmol/L）、陽性對照PPARα激動劑非諾貝特（F）組（10、20 μmol/L）。

1.2.2 細胞總RNA提取及反轉錄。細胞加藥后置于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養箱中培養24 h，收集細胞進行后續總RNA的提取，細胞RNA提取采用Trizol法。按照 cDNA 反轉錄試劑盒的說明書要求將提取的RNA反轉錄為cDNA，使用紫外核酸檢測儀測定RNA濃度。

1.2.3 熒光定量PCR檢測。實時熒光定量PCR體系為20 μL：Fast SYB R Mixture 10 μL；上下游引物各0.4 μL；模板cDNA 2 μL；RNase-Free ddH2O 7.2 μL。實時熒光定量PCR的反應程序：95 ℃預變性25 s；95 ℃變性3 s；60 ℃退火30 s；55 ℃延伸30 s。

2 結果與分析

2.1 細胞RNA的定量分析 高質量的RNA對于獲取cDNA極其重要。RNA溶液在260、280 nm下的吸光度值代表核酸和蛋白吸收值，可由此確定RNA的質量。OD260/OD280大于2.0時，說明RNA被降解成單核酸；OD260/OD280

小于1.8時，說明溶液中可能有蛋白等其他污染；OD260/OD280在1.8～2.0，說明提取出來的RNA純度和完整度滿足要求，可用于后續cDNA反轉錄試驗。

2.2 Gen對細胞PPARα、CPT-1的mRNA表達的影響 由圖1、2可知，整體上，油酸誘導組PPARα、CPT-1的mRNA表達略高于空白組。Gen試驗組內，不同劑量處理組與模型組相比， PPARα 、CPT-1的mRNA表達與Gen濃度呈正相關，即隨著Gen劑量的不斷增加，PPARα、CPT-1的mRNA表達也隨之增加，具有顯著的劑量效應，說明Gen能調節PPARα、CPT-1的mRNA表達。陽性藥物PPARα激動劑F組內，F對PPARα、CPT-1的mRNA表達有顯著的調控作用。4種細胞中Gen、PPARα激動劑F對人正常肝細胞L-O2、小鼠3T3-L1的上調力度大于2種人肝癌細胞HepG2、Hep3b，說明正常細胞與肝癌細胞之間可能存在著代謝機制上的差異。高劑量Gen的作用效果與PPARα激動劑一致，說明Gen對CPT-1的調節是經由PPARs通路實現的，通過上調PPARα的表達，增加下游靶基因CPT-1的表達，進而加強脂肪酸β-氧化，緩解因體內游離脂肪酸過多而導致大量甘油三酯的生成和積蓄。該結論揭示了Gen在緩解和改善NAFLD發生發展中脂肪酸氧化障礙上的重要作用，為尋找治療NAFLD的藥物研究提供了新的思路。

3 結論與討論

大豆異黃酮是大豆生長過程中產生的次級代謝產物，屬于多酚類混合物，多分布于大豆子葉和胚軸中，主要的食物來源是大豆及豆制品，三羥基異黃酮在大豆中主要以糖苷的形式存在，三羥異黃酮可作為維持機體代謝動態平衡，預防和治療與代謝綜合征、癌癥等相關的一些常見疾病的關鍵化學成分[10]。

脂肪在肝臟中的積累是由脂肪代謝異常引起的，其中脂肪酸氧化障礙導致的脂肪大量積聚，是NAFLD形成的主要原因之一。相關研究表明因過度積累的甘油三酯和高水平的游離脂肪酸等誘發的細胞毒性，導致線粒體功能發生障礙，脂肪酸氧化受阻，伴隨著氧化應激、活性氧生成及內質網應激的相應機制被激活進一步加劇NAFLD形成[11]。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）屬于Ⅱ型核激素受體超家族中的一員，是脂質激活的轉錄因子，調控機制一般是配體激活后與視黃醇類×受體（retinoid×receptor，R×R）形成異二聚體，與靶基因啟動子區的過氧化物酶體增殖物反應元件（peroxisome proliferator response element，PPRE）結合，從而調控目的基因的轉錄[12]。PPARs被配體激活后能發揮多種生物學效應，參與調控體內的脂肪細胞分化、葡萄糖代謝、脂肪酸代謝、炎癥反應等多種代謝活動，在維持機體正常生理生化過程中發揮了重要作用[13]。PPARα是PPARs核轉錄家族的一員，在脂肪合成、脂質代謝和胰島素敏感等生理代謝過程中，尤其是參與脂肪酸β氧化作用的一些重要酶類表達中，PPARs發揮著關鍵的調控作用[14]。當前，很多研究者已經把開發PPAR配體作為治療NAFLD的重要靶點[15]。相關試驗表明非諾貝特能通過改善肝脂肪變性，上調脂肪酸β氧化基因表達調控脂質積蓄，緩解脂肪肝，雖有一定效果，但在藥物毒性等方面還不盡如人意[16]。

該試驗以此為切入點深入研究Gen經由PPARs信號通路對脂肪酸代謝調控的具體作用機制，結果表明Gen對脂肪酸氧化關鍵性轉錄因子PPARα、關鍵限速酶CPT-1的調節作用與PPARα激動劑一致，能上調PPARα、CPT-1 mRNA的表達，且隨著Gen濃度的增加，上調幅度增加，呈顯著的劑量依賴效應。該試驗表明Gen通過PPARs信號通路，在促進脂肪酸氧化，使細胞脂肪酸含量減少，進而改善脂肪大量積聚現象，緩解和改善脂肪肝進程中發揮了重要作用。

目前對非酒精性脂肪肝的治療，還停留在預防、單一代謝功能紊亂的針對性治療、保守的延緩治療以及肝移植上，研制和開發特異性的具有多重藥理功效的藥物及其治療方式需要更多體內外試驗的成果、需要掌握更加全面的系統化代謝機制，并將理論、科學試驗和臨床測試科學地結合起來，這些都有待于更深一步的摸索與研究。

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