中藥金銀花植物遺傳多樣性研究進展

許蘭杰　梁慧珍　余永亮

摘要對金銀花在我國的分布及基因型分類進行分析，利用形態學標記、生化標記和分子生物學技術對中藥金銀花植物的遺傳多樣性進行研究，以期全面準確地了解金銀花的遺傳多樣性并對其進行保護，同時為開展金銀花遺傳改良提供理論依據。

關鍵詞金銀花；種質資源；遺傳多樣性

中圖分類號S567.+9文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2018）28-0022-03

Research Progress of Genetic Diversity of Germplasm Resources of Lonicera japonica

XU Lanjie，LIANG Huizhen，YU Yongliang et al（Sesame Research Center，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou ，Henan 450002）

AbstractDistribution and gene classification of Lonicera japonica were analyzed.Genetic diversity was studied by morphological marker，biochemical marker and molecular markers in Lonicera japonica.This research can provide theoretical basis for genetic improvement of Lonicera japonica.

Key wordsLonicera japonica；Germplasm resources；Genetic diversity

金銀花為忍冬科植物中中醫的常用藥物，金銀花富含芳樟醇和雙花醇等揮發油，以及綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等有機酸，黃酮類和皂苷類等化學成分，具有清熱解毒、涼散風熱之功效[1]。金銀花的花、葉和莖均可入藥。宋代以前只用莖和葉，明代則莖、葉、花同等入藥。但是不同部位其化學成分不同，功效不同。我國主要金銀花種質資源有忍冬屬植物98種，5亞種，18變種，在全國分布較廣，可供藥用的達49種。我國是金銀花的主產國，2003年，全國金銀花種植面積在0.2萬hm2以上，年產量8 000 t，而當時國內外市場需求量為20 000 t。2010年種植面積超過5.33萬hm2。金銀花壽命一般為10～20年，栽種3年后就可以產生效益，5年達到盛產。該研究主要對我國金銀花種質資源分類進行闡述，并綜述種質資源遺傳多樣性研究進展。

1我國金銀花種質資源研究

1.1我國金銀花主要產區分布

我國金銀花分布甚廣，主產于河南、山東，主要為栽培品種，此外，四川、廣西、江西、江蘇、陜西和甘肅等地均有野生[2]。

山東金銀花集中產于沂蒙山區，包括平邑、費縣、沂水、臨沭、濟南等地，已有300余年的栽培歷史，全省各山地丘陵均有野生。主要有毛花系列，包括小毛花、大毛花、九豐一號；雞爪花系列，包括小雞爪花、大雞爪花、細毛針（線花）、紅褲腿、麻針、大麻葉、中金一號等；野生花系列，包括野生忍冬、紅梗子；其他類，包括灰氈毛忍冬、紅金銀花。推廣種植的有費縣“中金一號”、平邑“九豐一號”。

河南是傳統的金銀花道地產地和栽培地，產于河南的稱為“南銀花”或“密銀花”。河南金銀花主產區有鄭州市所轄的新密、鞏義、滎陽等縣市，新鄉市所轄的封丘、原陽、輝縣、濮陽、許昌所轄禹州等縣，洛陽所轄汝州、偃師等縣，以及焦作、信陽、南陽的部分山區。近些年，在各地研究部門的培育下，出現諸多優良品種，基本上可以分為三大品系，即毛花系、雞爪花系和野生銀花系，共計十余個品種，種植規模較大的品種有“原陽一號”“豫封”系列、“封丘大毛花”“雞爪花”系列、“鑫蕾一號”、河南封丘“金豐一號”等。

其他產地如四川省可供藥用的主流品種為灰氈毛忍冬、細氈毛忍冬和淡紅忍冬；浙江省的主流品種為忍冬、紅腺忍冬、灰氈毛忍冬；甘肅省主流品種為盤葉忍冬、細氈毛忍冬和淡紅忍冬；湖南省主流品種為灰氈毛忍冬，此外，各個地區還有分布廣泛的野生忍冬植物。

1.2我國金銀花種質分類研究

1.2.1形態學分類研究。

植物形態學是最直觀的分類方式，目前已經應用于白芍、蒼耳等中藥植物的鑒別。張芳[3]依據金銀花植株形態特征差異證實了山東主產地的金銀花植株確實存在不同的種質，不同種質植株的形態特征與同工酶酶譜之間具有密切的關系，同工酶譜一致的植株形態特征相近。周鳳琴等[4]采用盛花期與非花期結合的方法進行種質調查，依據植物形態分類學知識進行品種的初步劃分，將主要金銀花種質劃分為3個系列16個品種。李林等[5]對浙江樂清、永嘉以及文成的金銀花進行調查，依據植物形態分類學知識將其原植物分為紅腺忍冬、灰氈毛忍冬以及引種河南的正品忍冬，野生種質在浙江也有分布，但是資源分散，未能夠形成商品。周鳳琴等[6]依據盛花期和非盛花期的植株形態差異對我國金銀花主產區的種質資源進行調查、收集與初步鑒定，確定山東平邑、河南新密為金銀花的道地產區，河南封丘、河北巨鹿為金銀花的新產區，山東平邑是中國金銀花種質資源分布中心。藍云龍等[7]采用形態性狀調查發現浙江西南地區的6個野生金銀花在形態性狀上差異較小。

1.2.2DNA水平上分類研究。

于燕莉等[8]采用RAPD標記方法對金銀花兩品系的DNA指紋圖譜進行分析，證明RAPD技術可以有效地用于金銀花品種的分類與鑒別。蔣超等[9]利用15對堿基數差異大于6的EST-SSR對52份金銀花類藥用植物進行分析，發現引物jp.ssr4、jp.ssr64及jp.ssr65可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。牛偉濤等[10]采用10個RAPD隨機引物成功構建巨鹿金銀花DNA指紋圖譜，可快速準確地將巨鹿金銀花與其他兩產地金銀花鑒別區分。徐石勇等[11]基于SNP標記技術，結合高分辨率溶解曲線分析技術（high resolution melting， HRM）對金銀花和山銀花的標志性SNP位點進行分析，可以快速地鑒別金銀花藥材的真偽。

2金銀花種質資源遺傳多樣性研究

2.1蛋白質水平

同工酶是基因編碼的產物，其酶譜差異主要是由決定酶蛋白本身的等位基因或非等位基因的差異造成的，同工酶電泳圖譜譜帶發生多態性變化，反映了生物在蛋白質水平上的多型性，是生物發生遺傳分化的證據[12]。目前，同工酶標記已廣泛應用于三七[13]、枸杞等[14]中藥種質的遺傳多樣性研究。趙永亮等[15]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術，利用過氧化物同工酶和淀粉酶同工酶對10個地區11個金銀花樣品的遺傳多樣性進行分析，表明不同產區金銀花的過氧化物酶和淀粉酶具有較豐富的多態性，說明金銀花不同居群在遺傳本質上是有區別的；聚類分析表明10個產區的11個金銀花樣品可聚為3個類群；不同產區金銀花的親緣關系與其遺傳本質和地理位置有關。

2.2DNA水平

2.2.1SSR標記。SSR（simple sequence repeats）標記是近年來發展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛星DNA（Microsatellite DNA），是一類由幾個核苷酸（一般為1～6個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列。徐石勇等[11]選擇25個SSR位點用于6個金銀花供試材料多態性分析，構建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，可對金銀花及其變種的遺傳多樣性進行分析，發現金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠，僅0.28；應用該指紋圖譜對87個市售金銀花進行分析，能夠區分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。

2.2.2RAPD標記。

向增旭等[16]利用RAPD分析技術對金銀花（Lonicera aponica Thunb.）6個種源的遺傳多樣性及遺傳關系進行研究，發現23個引物共擴增出多態性片段83條，金銀花的6個種源可聚為兩大類，產自山東平邑、湖南隆回和江蘇南京的野生金銀花種源遺傳距離較近，聚為一類；來自河南封丘的2個野生種源和來自河南密縣的1個栽培種源聚為一類。不同金銀花種源間的遺傳關系與地理分布有一定的相關性。蔣向輝等[17]用RAPD分子標記技術對7個不同來源的金銀花品種進行遺傳多樣性分析，發現以遺傳距離14.0 cM為界，可將7個不同金銀花種質分為三大類；第Ⅰ類為湘蕾金銀花與華南忍冬，第Ⅱ類為巨花1號與金塔1號，第Ⅲ類為九豐1號、魯峰巨豐與金花3號。趙東岳等[18]利用RAPD技術分析國內不同產區采集的11份栽培金銀花和1份山銀花樣品，17條RAPD引物共擴增出150條清晰可辨的DNA條帶；表明河南封丘、河北巨鹿的金銀花品種遺傳差異較小，品種較為單一；山東平邑的金銀花種質資源相對豐富；不同金銀花種源間的遺傳關系與地理分布存在相關性。Fu等[19]采用18對RAPD引物對5個金銀花品種進行遺傳多樣性分析，共擴增出147條帶，片段大小在300～2 000 bp，每個引物3～11個擴增片段；發現5個金銀花品種的相關性在0.59～0.77。 王一斐等[20]利用RAPD分子標記技術對膠東地區31個金銀花品種的遺傳多樣性進行研究，5個引物共擴增出650條帶；聚類分析結果表明，31個金銀花品種可以分為兩大類，采自昆崳山太白頂的金銀花品種為一類，其余30個金銀花品種為一類。從遺傳距離來看，采自昆崳山太白頂的品種與中醫世家引進金銀花品種大毛花遺傳距離最遠，為2.507；采自龍口蘭高鎮馬藺塔（Ⅱ）與中醫世家引進金銀花品種四季豐遺傳距離最近，為0.020。可以看出不同金銀花種源間具有較高的遺傳多樣性，不同金銀花種源間的遺傳關系與地理分布有一定的相關性。

2.2.3ISSR。

王曉明等[21]利用10條ISSR引物對以湖南、山東、河南的22個金銀花主要栽培品種進行遺傳多樣性分析，共擴增出多態性條帶96條；22個金銀花品種間的遺傳相似性系數為0.41～1.00，平均遺傳相似性系數為0.68；利用U PGM A進行系統聚類分析，22個供試金銀花品種劃分為兩大類，第1類為忍冬種群，第2類為灰氈毛忍冬種群，每個大類又分為北方種群與南方種群。王珊[22]采用15條具有多態性且重復性好的引物對湖南省不同產區的灰氈毛忍冬樣品進行ISSR標記研究，共擴增出多態性條帶161條，遺傳相似性系數變化在0.39～0.91。康玉秋[23]采用ISSR分子標記對12個雞爪花品系金銀花進行分析， 15條引物共擴增出多態性條帶240條，表明雞爪花品系金銀花的遺傳多樣性豐富，12個雞爪花品系金銀花品種可按地域性分為山東與河南新密兩大類，同一道地產區栽培品種的親緣關系較近；各農家品種間遺傳相似系數的變化在0.640 8～0.873 8。王湘瑩等[24]采用10個重復性高、擴增效果好的ISSR引物對23個金銀花品種的樣本進行PCR擴增，共獲得多態性條帶169條，23個金銀花品種間的遺傳相似系數在0.471 3～0.100 0，表明品種間的遺傳基礎較寬及遺傳多樣性較高。聚類分析（UPGMA）表明：23個供試金銀花品種劃分為忍冬、美國忍冬、灰氈毛忍冬三大類。韓琳娜等[25]應用16個多態性ISSR引物對27個金銀花原植物種質資源進行遺傳多態性、相似性和聚類分析；遺傳相似系數在0.50～0.90；27個品種可被聚為2個類群。孫稚穎等[26]對采自金銀花主產區的18個農家品種及 野生忍冬和近緣種灰氈毛忍冬共計36個樣品進行 ISSR-PCR 分析， 12條引物共擴增出多態性條帶為114條，表明金銀花種質資源具有較豐富的遺傳多樣性。 綜上所述，利用 ISSR標記可有效地分析金銀花種質資源的遺傳變異，為金銀花品種鑒別、分類、種質資源的有效利用提供理論依據。

2.2.4AFLP。

擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是通過對基因組DNA的限制性酶切片段進行選擇擴增而揭示其多態性，具有靈敏、穩定、多態性豐富等優點。利用AFLP技術在丹參[27]、黃蘗[28]等中藥種質資源中開展了遺傳多樣性研究。郭慶梅等[29]采用擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術對13個忍冬農家品種的遺傳多樣性進行初步分析，共獲得191條多態性條帶，表明同一道地產區的栽培品種親緣關系較近，山東種質基于AFLP標記的分類結果與形態特征基本一致。

3存在的問題與展望

我國金銀花育成品種栽培歷史悠久，種質資源豐富，但是金銀花相對遺傳基礎狹窄，基礎研究進展緩慢，大大制約了金銀花種質資源的開發利用和保存，導致金銀花品種退化、道地性差等問題。隨著DNA分子標記技術的快速發展，近年來，國內外學者對金銀花資源的收集、分類、種質評價及利用方面開展了很多研究，并取得諸多成果，使得金銀花的用途更加廣泛和明確。利用分子標記技術對金銀花進行合理分類、發現、鑒定和利用，將會有利于挖掘和利用我國的各種金銀花種質資源，提高育種效率，解決由于長期不規范的選育，金銀花的種質嚴重退化、盲目引種等問題。

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