周齡·初始注射時間對小鼠超數排卵的影響

鞏雪潔 臧敦安 許文豪

摘要 [目的]探討不同周齡、不同初始注射時間對小鼠超數排卵效果的影響。[方法]用10 IU PMSG+10 IU HCG間隔48 h處理C57BL/6J小鼠，收集并統計合子數。[結果]4周齡超排效果優于于8周齡，可達26.86枚∕只；4周齡C57BL/6J小鼠PMSG和HCG注射時間為12：00—13：00，超排后收集合子數可達30枚∕只以上，而且體外培養的發育狀況良好。[結論] 4周齡C57BL/6J小鼠適宜超數排卵；PMSG和HCG注射時間為12：00—13：00， 超排效果相對理想。

關鍵詞 小鼠；超排卵；激素；周齡；初始注射時間

中圖分類號 S865.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0072-03

Abstract [Objective]To discuss the influence of week-age and initial injection time on superovulation in mice. [Method]The C57BL/6J mice were treated with 10 IU PMSG+10 IU HCG interval 48h， and the number of zygotes was collected and counted. [Result] The effect of the four week age superovulation was better than that of eight weeks， and it could reach 26.86 . The time of PMSG and HCG injection of C57BL/6J mice at 4 weeks old was 12-13 at noon， and the number of zygotes collected was up to 30 and in vitro culture of the fertilized ovum was in good condition.[Conclusion]The 4-week old C57BL/6J mice are suitable for superovulation. When the injection time of PMSG and HCG is 12-13 at noon， the superovulation effect is relatively ideal.

Key words Mouse； Superovulation；Hormone；Week-age；Initial injection time

以各種外源促性腺激素誘發動物卵巢的許多卵泡發育并排出具有受精能力的卵子的過程稱為超數排卵（Superovulation），簡稱“超排”。1927年Smith和Engle首先在小鼠上發現了超排現象，隨后Cole和Hart發現孕馬血清（PMSG）可使未成熟的大鼠超排，奠定了超排的技術基礎[1]。我國20世紀70年代末牛、奶山羊超排后鮮胚移植成功。胚胎移植技術與當今生物科學、醫學及物種保存領域密切相關，而胚胎移植成功的關鍵是大量的優質胚胎，完善的超排卵技術就成了胚胎移植成功的首要條件。

近年來隨著基因工程小鼠的大量開發，小鼠的卵母細胞和胚胎需求量也日益增加。單靠自然排卵，耗時耗力，也很難滿足研究需要，成熟的超排卵技術可以大幅提高動物的生產效率。小鼠的超排受內外多種因素的影響，超排效果極不穩定。影響小鼠超排效果的因素主要有小鼠的品系、周齡、生理周期，激素的劑量、注射時間、間隔時間。研究者的報道中，小鼠超排的激素劑量和周齡沒有完全統一，且對昆明小鼠超排的研究相對比較完備，但對C57BL/6J小鼠超排的研究相對較少，而C57BL/6J小鼠在基因工程小鼠研究中應用非常廣泛。

筆者采用孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）對小鼠進行超數排卵，通過不同周齡、注射時間的小鼠超排效果的比較，進一步完善小鼠超數排卵方案，為完善小鼠，尤其是C57BL/6J小鼠的超數排卵技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物。選用4～10周齡未交配過的C57BL/6J小鼠（購自湖北省實驗動物研究中心），動物質量許可證號碼為SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 試劑。①孕馬血清促性激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），寧波市三生藥業有限公司生產，生產批號S170106；血促性素專用稀釋液，寧波市三生藥業有限公司生產，生產批號C161210。用血促性素專用稀釋液配成100 IU/mL的儲備液，-20 ℃儲存備用。②人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG），寧波人健藥業集團股份有限公司生產，生產批號170112。用生理鹽水配成100 IU/mL的儲備液，-20 ℃儲存備用。③胚胎操作液：M2小鼠胚胎收集專用培養液（Sigma）；胚胎培養液：KSOM小鼠胚胎專用培養液（Sigma）；透明質酸酶濃儲液（Sigma H4272）：用M2培養液稀釋至0.01%；石蠟油（Sigma）。

1.1.3 儀器。尼康T-S雙端口倒置顯微鏡、Memmert INC108 med CO2 培養箱、國產體視顯微鏡、用硬玻璃毛細管（1.5 mm外徑）自制的吸卵管、一次性塑料35 mm培養皿、康寧18 mm培養皿。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的準備。將購買回來的小鼠放入中南民族大學實驗動物中心SPF級實驗動物檢疫間內，進行試驗前7 d的環境適應性飼養和檢疫，無異常的小鼠用于超排處理。SPF級動物實驗室的環境按照國家標準進行控制：溫度23～25 ℃，濕度55%±5%，室內光照為12 h∶12 h明暗（08：00—20：00）交替，空氣為一萬級凈化。

1.2.2 小鼠的分組。同一周齡的小鼠歸為1組，用同樣周齡的22只小鼠進行試驗。3—5月進行超排處理的小鼠記為春季組，6—8月進行超排處理的小鼠記為夏季組，9—11月進行超排處理的小鼠記為秋季組，12月—次年2月進行超排處理的小鼠記為冬季組。

1.2.3 小鼠的超數排卵處理。

1.2.3.1 注射PMSG 10 IU。第1天下午，挑選同一周齡的雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射PMSG 10 IU。

1.2.3.2 注射HCG 10 IU。第3天下午同一時刻，即間隔48 h，每只小鼠腹腔注射HCG 10 IU，與種雄鼠按照1∶1的比例合籠。

1.2.3.3 制移卵管。①在酒精燈外焰上輕烤玻璃管，使之軟化；②玻璃管離開火焰，迅速拉伸玻璃管兩端，產生1個內徑200～250 μm的管；③為使玻璃管口平整，用小砂輪片將玻璃管切割后，迅速折斷；④移卵管口接觸火焰后迅速撤離，可減少操作過程中對透明帶的傷害。

1.2.3.4 受精卵的獲取。第4天09：00取懷孕0.5 d的小鼠，斷頸處死，腹面朝上放在吸水紙上，立刻用75%乙醇噴灑小鼠腹部，盡量減少毛發污染。迅速打開腹腔，暴露子宮和輸卵管。輕輕將子宮、輸卵管、卵巢和脂肪墊拉出體腔，用鑷子尖在靠近輸卵管的膜上開一小口，將輸卵管和少部分帶著的子宮轉移到已滅菌的35 mm培養皿里（加有預熱至37 ℃的M2培養液滴）。在20倍體視顯微鏡下，找到輸卵管膨大的壺腹部，用胚胎操作針將其刺破，并引流至M2培養液滴中，用自制的玻璃移卵管，將卵丘細胞包圍的一團合子轉移到透明質酸酶液滴中，消化30 s。然后用口吸管將合子收集到新鮮M2培養液滴中，用移卵管上下吹洗幾次，去除殘留的透明質酸酶、卵丘細胞和雜質。

1.2.3.5 受精卵的體外培養。將受精卵轉移到預先在37 ℃、5%CO2平衡24 h的KSOM培養液滴（石蠟油液封的微滴）中，放入CO2培養箱培養3 d，培養密度一般為每20 μL 10～15枚。顯微鏡下觀察統計不同時段受精卵發育的狀態。

2 結果與分析

2.1 周齡對C57BL/6J小鼠超排的效果

由表1可知，10 IU PMSG+10 IU HCG間隔48 h處理小鼠，4周齡取合子數明顯比8周齡多。4周齡和8周齡C57BL/6J的超排效果比較，4周齡優于8周齡。

2.2 季度對C57BL/6J小鼠超排的影響

由圖1可知，C57BL/6J小鼠秋季組超排效果好于冬季組，秋季組小鼠的取合子數為30枚以上，而冬季組同樣激素的劑量處理4周齡、5周齡、6周齡小鼠，收集的合子數差別不大，效果都不理想。秋季超排實驗，6周齡小鼠的取合子數比4周齡、5周齡略微好一些。

2.3 PMSG初始注射時間對C57BL/6J小鼠超排的影響

由圖2可知，對于4周齡C57BL/6J小鼠，12：00—13：00初始注射PMSG可獲得比較多的合子；而5周齡C57BL/6J小鼠13：00、17：00初始注射PMSG，均可獲取比較多的合子；8周齡C57BL/6J小鼠13：00初始注射PMSG，超排效果最佳。若初始PMSG時間相同，同一天的12：00、13：00、15：00、16：00、17：00注射PMSG，不同周齡的小鼠超排效果差異比較明顯。

2.4 C57BL/6J小鼠受精卵的體外培養

由圖3可知，用KSOM胚胎培養液培養C57BL/6J小鼠的受精卵，1.5 d后有雙原核的受精卵基本都可發育至2-細胞，2-細胞的2個分裂球對稱均勻，顏色清晰，透明帶完整光滑。3.5 d后2-細胞中的絕大部分可發育至囊胚階段，極少部分皺縮退化。KSOM胚胎培養液中小鼠受精卵發育的同步化程度較高。

3 結論與討論

3.1 周齡對超排的影響 宋紹征等[2]比較了5周齡與8周齡C57BL/6J的超排效果，發現8周齡效果略好； Esmail等[3]發現4周齡C57BL/6J更適合超排 ；陳曉娟等[4]比較了獲得的卵母細胞數、2-細胞數等，認為4周齡C57BL/6J超排更好；而Kolbe等[5]認為21～32日齡比32日齡以上的C57BL/6J小鼠獲得的卵母細胞更多。該實驗后期采用4周齡C57BL/6J小鼠進行超排。

3.2 注射時間對超排的影響 對大多數小鼠品系來說，內源黃體素（LH）的釋放時間為注射PMSG之后的第2個暗期中點之后的15～20 h，而排卵發生在注射HCG后10～13 h，但要人為控制排卵時間，就需在內源LH釋放前注射HCG。唐一岷等[6]認為C57BL/6J小鼠超排后14～15 h取的卵最多；陳曉娟等[4]發現，4周齡的C57BL/6J小鼠對PMSG應答產生的內源黃體素（LH）釋放量不足以引起排卵，HCG注射時間為注射PMSG后48～49 h，此時獲得卵母細胞數較多。該實驗中4周齡的C57BL/6J小鼠內源性LH釋放不足，排卵的高峰時間就和上述的“HCG10～13 h”不一致。實驗結果顯示，注射PMSG（10 IU）時間為第1天12：00—13：00，間隔48 h同樣的時間再注射HCG（10 IU），注射HCG后18～21 h取胚，也能獲得比較好的超排效果。

3.3 C57BL/6J小鼠早期胚胎體外發育 小鼠的早期胚胎即從受精卵開始經過卵裂、2-細胞、8-細胞、桑椹胚、囊胚等階段，尚未與子宮建立組織聯系的游離階段的胚胎。體外培養效率首先依賴于超排獲得優質的卵母細胞和受精卵。該實驗中小鼠受精卵收集時間固定為第4天09：00。光照周期為05：00—19：00，PMSG時間也相應提前到中午，才能保證受精卵的存活率[7]。而Takeo等[8-10]采用其他激素（IAS和eCG，輔以體外授精（IVF）， 2-細胞百分比、原代出生率都非常可觀。該實驗采用自然交配獲得受精卵，發育到2-細胞的百分比可達27.91%。后續實驗若采用IVF，受精率可大幅提升，能進一步提高小鼠早期胚胎體外發育質量。實驗小鼠的發情周期、營養狀況對超排效果的影響還有待進一步研究。

參考文獻

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[3] ESMAIL M Y， QI P， CONNOR A B， et al. Generating chimeric mice by using embryos from nonsuperovulated BALB/c mice compared with superovulated BALB/c and albino C57BL/6 mice[J].Journal of the American association for laboratory animal science，2016，55（4）：400-405.

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[9] TAKEO T，NAKAGATA N.Efficient production of mouse oocytes using superovulation by immunization against inhibin[J].Transgenic research，2016，25（2）：211-212.

[10] TAKEO T，NAKAGATA N.Immunotherapy using inhibin antiserum enhanced the efficacy of equine chorionic gonadotropin on superovulation in major inbred and outbred mice strains[J]. Theriogenology，2016，86（5）：1341-1346.