雞胸軟骨膠原的提取及其結構表征

張艷艷 劉海英

摘要 [目的]提取雞胸軟骨中的膠原，并對其進行檢測。[方法]以雞胸軟骨為原料，采用酶法提取其中的膠原，并進行紫外光譜檢測、傅里葉變換紅外光譜檢測、SDS-PAGE、氨基酸分析、圓二色譜檢測及肽指紋圖譜檢測。[結果]膠原的提取率是0.11%（以濕重計），紫外最大吸收波長為217 nm；SDS-PAGE顯示，膠原含有一條較粗的α帶和一條較細的β帶；氨基酸分析顯示，羥脯氨酸為99殘基/1 000氨基酸殘基。[結論]該方法提取得到的膠原是典型的Ⅱ型膠原，且很好地保持了其天然結構，具有較高的純度。

關鍵詞 膠原；雞胸軟骨；Ⅱ 型膠原；提取；結構表征

中圖分類號 S879；TS251.92文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）15-0155-03

Abstract [Objective]The research aimed to extract collagen from chicken sternal cartilage and detected it.[Methods]Using chicken sternal cartilage as raw material，the collagen was extracted by enzymatic method and detected by ultraviolet spectroscopy，Fourier transform infrared spectroscopy，SDS-PAGE，amino acid analysis，circular dichroism detection and peptide fingerprint detection.[Result]The extraction rate of collagen is 0.11%，based on the wet weight of chicken sternal cartilage.Ultraviolet spectral analysis showed that the characteristic absorption wavelength of collagen was 217 nm.Analysis results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide-gel electrophoresis（SDS-PAGE） showed that there was a heavy α-chain and a light β-chain.Amino acid components showed that hydroxyproline was 99 imino acid residues/1 000 residues.[Conclusion]The collagen extracted by this method is a typical type Ⅱ collagen，and its natural structure is well maintained with high purity and the product has a high purity.

Key words Collagen；Chicken sternal cartilage；Type Ⅱ collagen；Extraction；Structural characterization

膠原是一類具有獨特結構的蛋白質，廣泛存在于動物組織中，是哺乳動物細胞中最豐富的蛋白質，約占整個細胞總蛋白的1/4[1]。Ⅱ 型膠原主要存在于動物的白色結締組織中[2]，由3條相同的α1（Ⅱ）鏈以超螺旋的方式構成軟骨的基本結構，具有維持關節軟骨的形態結構和抗張力強度的功能[3]。Ⅱ 型膠原特有的結構和化學組成使其在生物醫學材料、化妝品及食品等領域得到了廣泛應用。近年來研究表明，Ⅱ 型膠原還可以作為藥物和保健品來防治類風濕性關節炎（RA）。

我國禽肉加工產量較高，每年在禽類加工過程中都會產生大量的雞胸軟骨等副產品。以往雞胸軟骨大多被當作廢棄物直接丟棄或用作飼料生產，造成了環境污染和大量的資源浪費。Ⅱ型膠原是雞胸軟骨中的主要成分。筆者以雞胸軟骨為原料，采用酶法提取Ⅱ型膠原并對其結構和性質進行研究，旨在為充分利用雞骨資源、減少環境污染、解決禽類加工資源綜合利用等問題，并獲得一種具有高附加值的生物活性物質提供依據，具有重要的理論意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸軟骨，市場購買；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京博特森生物技術有限公司；標準蛋白（分子量6.5～270.0 kDa），上海碧云天生物技術有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X），上海碧云天生物技術有限公司；胃蛋白酶（1 200 U/g），國藥化學試劑有限公司；透析袋（8 000～140 000 Da）；考馬斯亮藍G250、甲醇、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、乙酸、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）等，均為分析純。

1.2 主要儀器

Agilent1100氨基酸分析儀，美國安捷倫公司；UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；IS10傅立葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；1658001 Bio-Rad伯樂Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司；UltrafleXtreme基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜儀，布魯克·道爾頓公司；MOS-450圓二色光譜儀，法國Biologic公司；77530-30LABCONCO6L凍干機，照生有限公司；5424 Eppendorf臺式高速離心機，德國Eppendorf艾本德股份有限公司；電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋，江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 膠原提取工藝流程。雞胸軟骨→清洗→去骨膜→切碎→脫脂→凍干→浸提→鹽析→透析→凍干→成品。

1.3.2 膠原提取步驟。

1.3.2.1 雞胸軟骨的預處理。

將冷凍的雞胸軟骨，用蒸餾水清洗干凈，去除骨膜，切成約2 mm×2 mm×2 mm的小塊，混懸于10%正乙烷中，攪拌，每8 h更換1次，連續浸泡24 h去脂。蒸餾水沖洗數次后，預凍，真空冷凍干燥48 h，-20 ℃保存備用。

1.3.2.2 膠原的提取。所有操作均在4 ℃條件下進行。將凍干的雞胸軟骨，浸泡于含有1%（W/V）胃蛋白酶、料液比為1∶20的0.5 mol/L HAc溶液24 h[4]，用滴管逐滴加入溶解完全的NaCl溶液[5]，使NaCl最終濃度為0.9 mol/L，鹽析出絮狀物，4 000 r/min，10 min，棄去上清液體，沉淀即為粗制Ⅱ型膠原。將沉淀溶解于0.5 mol/L HAc溶液中，如此重復鹽析、沉淀、離心純化3次，使用分子截留量為8 000～14 000 Da的透析袋，用0.5 mol/L HAC透析72 h后，預凍，真空冷凍干燥后即為純化后的Ⅱ型膠原。將凍干的樣品保存在-20 ℃下備用。

1.3.2.3 提取率計算。膠原提取率=凍干所得的膠原質量/雞胸軟骨質量×100%。

1.3.3 膠原的檢測與結構表征。

1.3.3.1 紫外光譜（UV）檢測法。

將樣品溶于0.05 mol/L HAc溶液中，配制成濃度為0.3 mg/mL的膠原溶液。以0.05 mol/L的HAc溶液作為空白，在190～400 nm波長下進行紫外光譜檢測。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）檢測法。

將樣品與KBr固體（1∶100）混勻，研磨，壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀，于4 000～400 cm-1進行掃描，分辨率為4 cm-1，掃描頻率為16次。

1.3.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳。

按照Laemmli[6]將樣品溶于適量上樣緩沖液，配制成10 mg/mL的膠原溶液，煮沸3 min，自然冷卻，4 000 r/min離心10 min。采用標準蛋白標記，分離膠和濃縮膠分別為6%和5%，上樣量為4 μL。先于80 V電壓下電泳30 min，后于120 V下電泳100 min。電泳結束后，凝膠用考馬斯亮藍R-250染色30 min，脫色液脫色3～4次，每次30～40 min。

1.3.3.4 肽指紋圖譜。

按照“1.3.3.3”所述制備電泳凝膠。電泳結果表明，雞胸軟骨中膠原主要由一條較粗的α帶和一條較細的β帶構成。為了進一步證實膠原為 Ⅱ 型膠原，切除 α亞基，經脫色、酶解、萃取、點樣后，通過質譜測定出各片段的準確質量，然后將獲得的數據在蛋白質數據庫中進行搜尋、鑒定[7]。

1.3.3.5 氨基酸分析。

稱取100 mg樣品，溶于8 mL的6 mol/L HCl中，充氮氣3 min，溶液呈微沸狀態，密封，120 ℃烘箱中水解22 h，加4.8 mL 10 mol/L NaOH中和，定容，雙層濾紙過濾，15 000 r/min，離心10 min，取上清液于氨基酸自動分析儀分析。

1.3.3.6 圓二色譜。

將樣品溶于0.05 mol/L HAc溶液，配成濃度為0.3 mg/mL膠原溶液，在190～250 nm波長下平均掃描3次；并在218 nm處對膠原溶液進行溫度掃描，溫度為19～50 ℃，獲得膠原溶液的變性曲線，變性溫度即為變化率一半時所對應的溫度。

2 結果與分析

2.1 雞胸軟骨膠原的提取率 經計算，雞胸軟骨膠原的提取率為0.11%（以濕重計）。

2.2 膠原的檢測與結構表征

2.2.1 UV檢測法。

雞胸軟骨的紫外吸收光譜如圖1所示。膠原的肽鏈中含有C=O、COOH、CONH2等生色基團，可以在近紫外區檢測到吸收峰。從圖1可以看出，在217 nm處有一個最大吸收峰，與 Ⅱ 型膠原的紫外特征吸收峰較吻合。

2.2.2 FTIR檢測法。

圖2是雞胸軟骨中所提取的Ⅱ型膠原的傅里葉紅外光譜圖。由圖2可知，Ⅱ 型膠原的紅外圖譜有4個特征吸收峰，分別為3 370、2 930、1 640和1 540 cm-1，分別命名為酰胺 A帶、酰胺 B 帶、酰胺 I 帶和酰胺 Ⅱ 帶。一般情況下，酰胺A帶和酰胺B 帶主要是N-H 的伸縮振動，酰胺I帶是C=O的伸縮振動和N-H 的彎曲振動，酰胺 Ⅱ 帶是 N-H 的彎曲振動和 C-N 的伸縮振動。將該紅外吸收圖譜與文獻[8]中報道的天然Ⅱ型膠原的圖譜對照，該圖中的波數和吸收峰位置與其基本一致，說明該研究中的提取工藝沒有破壞 Ⅱ 型膠原的天然結構。

2.2.3 SDS-PAGE凝膠電泳法。

根據雞胸軟骨膠原的電泳結果（圖3），該試驗提取的膠原樣品的譜帶顯示，與曹慧等[4]的電泳圖譜結果一致。圖中，樣品出現2個條帶，由于Ⅱ型膠原主要由3條相同的α1（Ⅱ）鏈構成，所以電泳圖譜中出現一條含量較高的α帶和少量的β二聚體，二者的分子量分別位于130和250 kDa的位置。

2.2.4 肽指紋圖譜。雞胸軟骨膠原的肽指紋質譜結果顯示，鑒定了膠原的α條帶，獲得注冊號為gi31340542，分子量/PI為120043/7.22，得到1%的重疊范圍，總評分為63分，一共有1個肽段相匹配。通過MALDI—TOF/TOF質譜法分析了雞胸軟骨膠原的α條帶，結果中的分數> 61表示同一性或廣泛同源性（P<0.05），結果可信。

2.2.5 氨基酸分析。

從雞胸軟骨膠原氨基酸組成（表1）可以看出，主要氨基酸是甘氨酸（250殘基/1 000氨基酸殘基），其次為谷氨酸（128殘基/1 000氨基酸殘基）、丙氨酸（101殘基/1 000氨基酸殘基）、羥脯氨酸（99殘基/1 000氨基酸殘基），符合Ⅱ型膠原的特征[9]。

2.2.6 圓二色譜。

圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質結構的一種快速、簡單的方法[10]。蛋白質中氨基酸的α-碳原子是不對稱的，具有光學活性；蛋白質的肽鏈走向也是不對稱的，也具有光學活性。當平面偏振光通過這些光活性的生色基團時，光活性中心對平面圓偏振光中的左右圓偏振光的吸收不相同，產生了吸收差值，由于這種吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圓偏振光變成了橢圓偏振光，這就是蛋白質的圓二色性。一般蛋白質的圓二色光譜分成兩段，波長在185～245 nm 稱為遠紫外區，245～320 nm 稱為近紫外區。遠紫外區是蛋白質肽鏈的吸收峰，反映了主鏈的構象。

雞胸軟骨中提取的膠原在遠紫外區的圓二色譜如圖4所示，197 nm處存在一個負峰，223 nm處存在一個正峰，說明膠原三股螺旋保持較好，符合膠原三股螺旋典型特征的圓二色譜峰型。

物質在溫度變化過程中，往往伴隨著微觀結構、宏觀的物理和化學性質等變化。膠原的熱變性溫度（Ts）是反映其天然螺旋結構的重要指標之一。當體系的溫度達到Ts時，膠原分子從伸展的纖維態轉變為無規卷曲狀，即膠原變性為明膠。圖5是雞胸軟骨膠原的變性曲線，由圖可見，變性溫度為39 ℃。

3 結論

Ⅱ型膠原分子間通過交聯鍵相連使各分子間相互聚合成大分子穩定結構，所以，Ⅱ型膠原是一種難溶性蛋白。這種特性阻礙了膠原的提取。鑒于以上情況，試驗選用酸溶液-胃蛋白酶體系，使之成為可溶性并保持膠原分子的完整性。該試驗采用酶法對雞胸軟骨膠原進行提取，并對其進行UV、FTIR、SDS-PAGE和CD等檢測，證明所提膠原為Ⅱ 型膠原。我國是養雞大國，雞胸軟骨產量較大，但作為禽產品加工的主要副產物并沒有得到充分的開發和利用，因此開發利用雞胸軟骨資源用以生產Ⅱ型膠原，提高其附加值，具有極大的經濟意義。

參考文獻

[1] 張達江，王亮.Ⅰ 型膠原蛋白的結構、功能及其應用研究的現狀與前景[J].生物技術通訊，2006，17（2）：265-269.

[2] 莎麗娜，李振飛，韓天翔.羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白提取中脫鈣、脫脂工藝的改進[J].內蒙古農業大學學報（自然科學版），2012，33（4）：136-139.

[3] 顧其勝，蔣麗霞.膠原蛋白與臨床醫學[M].上海：第二軍醫大學出版社，2003.

[4] 曹慧，許時嬰.雞關節軟骨Ⅱ型膠原的制備[J].食品科學，2007，28（4）：148-152.

[5] MILLER E J，GAY S.Collagen：An overview[J].Methods in enzymology，1982，11（82 Pt A）：3-32.

[6] LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970，227（5259）：680-685.

[7] DALLUGE J J.Matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry （MALDI-MS）[J].Anal Bioanal Chem，2002，372：18-19.

[8] CAO H，XU S Y.Purification and characterization of type Ⅱ collagen from chick sternal cartilage[J].Food chemistry，2008，108（2）：439-445.

[9] 姜旭淦，陳盛霞，王卉放，等.可溶性Ⅱ型膠原蛋白提取純化條件的研究[J].臨床檢驗雜志，2006，24（6）：418-421.

[10] 段蕊，葉超，邢芳芳，等.采用圓二色譜法研究冬夏鰱魚鱗膠原蛋白的穩定性[J].食品與發酵工業，2010，36（1）：73-76.