蟬花菌種的分離·鑒定及蟬花營養(yǎng)成分測定

邢康康 石萍 賀宗毅

摘要[目的]研究蟬花菌種的分離、鑒定及蟬花營養(yǎng)成分測定。[方法]對(duì)從重慶梁平地區(qū)采集得到的蟬花進(jìn)行菌種分離和鑒定，并對(duì)蟬花的營養(yǎng)成分進(jìn)行測定。[結(jié)果]分離菌株為蟬擬青霉菌（Paecilomyces cicadae），蟬花含有粗多糖、腺苷、甘露醇、氨基酸等營養(yǎng)成分。[結(jié)論]該研究為重慶梁平地區(qū)蟬花資源的開發(fā)利用提供參考，對(duì)擴(kuò)大傳統(tǒng)中藥資源、進(jìn)一步深入研究該菌株的藥理作用和人工栽培技術(shù)具有重要意義。

關(guān)鍵詞蟬花;分離鑒定;系統(tǒng)發(fā)育分析;營養(yǎng)成分

中圖分類號(hào)R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0162-02

Separation and Identification of the Strain from Cordyceps cicadae and Determination of the Nutrient Content of Cordyceps cicadae

XING Kangkang，SHI Ping，HE Zongyi et al（1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica， Chongqing 400065;2.Chongqing Sericulture Science and Technology Research Institute， Chongqing 400700）

Abstract[Objective] The research aimed to study the the isolation， identification of the strain from Cordyceps cicadae and determination of the nutrient content of Cordyceps cicadae.[Method]The Cordyceps cicadae strains collected from the Liangping area in Chongqing were isolated and identified， and the nutrient content of Cordyceps cicadae were determined.[Result]The isolated strain was Paecilomyces cicadae and Cordyceps cicadae contained many nutrient contents such as crude polysaccharide， adenosine， mannitol， amino acids and so on.[Conclusion]This study provides reference for the development and utilization of Cordyceps cicadae resources in Liangping area of Chongqing. The results are of great significance for expanding traditional Chinese medicine resources and further researching the pharmacological effects and artificial cultivation techniques of the strain.

Key wordsCordyceps cicadae;Isolation and identification;Phylogenetic analysis;Nutrient content

蟬花俗稱蟬蟲草、蟬茸、胡蟬等，是蟬擬青霉 （Paecilomyces cicadae） 等麥角菌科（Claviceptaceae）真菌寄生于一些蟬若蟲后形成的菌蟲復(fù)合體[1]。《圖經(jīng)本草》記載：“今蜀中有一種蟬，其蛻殼頭上有一角，如花冠狀，謂之蟬花。”《本草綱目》記載：“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。現(xiàn)代研究表明，蟬花中含有糖原、甘露醇、多種生物堿、蛋白質(zhì)、多種氨基酸以及多種微量元素等化學(xué)成分，且糖類和蛋白質(zhì)的含量相對(duì)較高[2]，具有免疫調(diào)節(jié)、代謝調(diào)節(jié)、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、改善腎功能、降血糖、抗腫瘤等藥理作用。

蟬棒束孢的寄主廣泛，常見的有竹蟬（Platylomia pieli）、山蟬 （Cicada flammata）、蟪蛄 （Platyleura kaempferi）、云南黑蟬 （Cicadatra shaluensis）、草蟬（Mogannia conica）、小鳴蟬 （Oncotympana ella）和透翅蟬 （Hyalessa roils），多分布在我國南方諸省[3]。不同地區(qū)不同生境采集的蟬花分離物，極具物種多樣性，它們之間在形態(tài)和遺傳上具有明顯的差異，且不同菌株的藥理作用及生物活性含量差異明顯[4]。筆者對(duì)重慶梁平地區(qū)野生蟬花菌種進(jìn)行分離、鑒定，并對(duì)蟬花營養(yǎng)成分開展研究，有利于為當(dāng)?shù)叵s花資源的開發(fā)利用提供參考，對(duì)擴(kuò)大傳統(tǒng)中藥資源、進(jìn)一步深入研究該菌株的藥理作用和人工栽培技術(shù)具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料蟬花于2017年7月采集于重慶梁平，編號(hào)CCS01。

1.2培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L，pH自然。121 ℃滅菌20 min。

1.3蟬花真菌的分離、純化

1.3.1蟲體分離法。取新鮮蟬花，75%乙醇消毒，選取蟲體胸足為界的前段部分，用鑷子撕開表皮，取胸腔中菌體少許，接入分離培養(yǎng)基，于25 ℃培養(yǎng)。待菌落長至0.2～0.5 cm時(shí)，挑選少量菌絲在分離培養(yǎng)基上純化2～4次，確定無雜菌后移入試管培養(yǎng)保存。

1.3.2子座分離法。取新鮮蟬花，從僵蟲頭頂切下子座芽，75%乙醇消毒，用鑷子撕開表皮，切取中間部位組織塊接入培養(yǎng)基，置25 ℃培養(yǎng)。待菌落長至0.2～0.5 cm時(shí)，挑選少量菌絲在分離培養(yǎng)基上純化2～4次，確定無雜菌后移入試管培養(yǎng)保存。

1.3.3孢子分離法。取新鮮蟬花，從僵蟲頭頂切下子座芽，75%乙醇消毒，用無菌棉包裹子座基部倒置于斜面試管口，讓孢子自然彈落到分離培養(yǎng)基上，置25 ℃培養(yǎng)。待菌落長至0.2～0.5 cm時(shí)，挑選少量菌絲在分離培養(yǎng)基上純化2～4次，確定無雜菌后移入試管培養(yǎng)保存。

1.4蟬花真菌的鑒定

1.4.1形態(tài)鑒定。

挑取蟬花菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)。

1.4.2ITS分子鑒定。

將野生蟬花樣品風(fēng)干后抽提DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA抽提結(jié)果。設(shè)計(jì)ITS序列引物，將抽提的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。獲得的序列經(jīng)BLAST比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定分離菌株的分類地位。

1.4.3DNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

將測序獲得的ITS序列通過BLAST比對(duì)，根據(jù)同源性相似度差異，利用Clustal X（Version 1.83）軟件進(jìn)行多序列匹配排列，用軟件MAFFT version 7鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)分離菌株與Genebank數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析。

1.5蟬花的營養(yǎng)成分分析

1.5.1氨基酸含量分析。

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》GB 5009.124—2016，采用氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）測定蟬花中的氨基酸。

1.5.2粗多糖含量測定。

按照《保健食品功效成分檢測方法》將蟬花中多糖成分經(jīng)乙醇沉淀分離后，加酸、加熱、回流水解成單糖，以次甲基藍(lán)作為指示劑，在加熱條件下，滴定經(jīng)標(biāo)定過的堿性酒石酸鉀鈉銅溶液，根據(jù)樣品液消耗體積，計(jì)算其含量。

1.5.3腺苷及甘露醇含量測定。

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版規(guī)定，蟬花中腺苷用超聲波提取后采用液相色譜測定含量。按照《中華人民共和國藥典》2015版一部，采用高效液相色譜法測定甘露醇含量。

2結(jié)果與分析

2.1菌株鑒定 在PDA平板上形成的菌落為圓形，表面蓬松，菌絲初始為白色，繼續(xù)培養(yǎng)呈淡黃色。星狀放射生長、菌絲平伏，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑取。經(jīng)ITS區(qū)測序，BLAST比對(duì)，綜合鑒定結(jié)果為蟬擬青霉。

2.2分子系統(tǒng)學(xué)分析

根據(jù)蟬花分離菌株CCS01系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），分離菌株CCS01的ITS序列與蟬花 （Cordyceps cicadae） KY924492菌株、蛇腹蟲草 （Ophiocordyceps sobolifera） JQ283963菌株、細(xì)腳棒束孢 （Isaria tenuipes） MG833296菌株、炭角棒束孢 （Isaria xylariiformis） FJ479746菌株、雙節(jié)棍孢子植生蟲草 （Phytocordyceps ninchukispora） EF411226菌株的相似度均為100%;與大蟬草 （Ophiocordyceps sobolifera） JQ283963，茶色黏傘 （Limacella glioderma） FJ478086，蟬擬青霉 （Paecilomyces cicadae） HQ87463、AF368801、GU194182.1，下垂蟲草（Cordyceps nutans） AJ536559，蛹蟲草（Cordyceps takaomontana） KY075927 菌株序列的相似度為99%。結(jié)合Genebank上的12個(gè)蟲草有關(guān)序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。分枝統(tǒng)計(jì)支持率評(píng)估采用Bootstrap法，自展值為1 000。由圖1可知，所有序列形成2個(gè)大的分支，除蛹蟲草 （Cordyceps takaomontana） KY075927菌株自成一支外，菌株CCS01和其余蟲草相關(guān)真菌聚成一個(gè)大的進(jìn)化分支。

2.3營養(yǎng)成分分析

根據(jù)蟬花營養(yǎng)成分測定結(jié)果（表1），從蟬花中共檢測到16種氨基酸，總含量為22.26%。其中蛋氨酸和谷氨酸含量較高，分別為3.07%和2.09%。含有賴氨酸（1.29%）、亮氨酸（1.07%）、異亮氨酸（0.63%）、苯丙氨酸（0.75%）、蛋氨酸（3.07%）、蘇氨酸（1.02%）、纈氨酸（0.87%）7種必需氨基酸，只有色氨酸未檢測到。經(jīng)測定，蟬花中粗多糖含量為0.61%，腺苷含量達(dá)到10.80 mg/kg，甘露醇的含量為5.13%。

3小結(jié)與討論

該研究以重慶梁平蟬花CCS01為樣品，從菌種分離、鑒定和營養(yǎng)成分測定三方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過形態(tài)觀察與ITS比對(duì)分析，該菌株綜合鑒定結(jié)果為蟬擬青霉，其ITS序列長度為517 bp，與蟬花 （Cordyceps cicadae） KY924492菌株、蛇腹蟲草 （Ophiocordyceps sobolifera） JQ283963菌株、細(xì)腳棒束孢 （Isaria tenuipes） MG833296菌株、炭角棒束孢 （Isaria xylariiformis） FJ479746菌株、雙節(jié)棍孢子植生蟲草 （Phytocordyceps ninchukispora） EF411226菌株的相似度均為100%。

多糖是蟬花的主要生物活性成分之一，具有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗衰老等藥理活性[5]。測定梁平蟬花中粗多糖含量為0.61%，遠(yuǎn)低于廣州地區(qū)蟬花（2.85%）[6]。腺苷具有降低血壓、鎮(zhèn)靜、抗癲癇、催眠等生理功能，還有能量轉(zhuǎn)移、信號(hào)傳遞、抑制脂肪分解等生理功能[7-8] 。梁平蟬花中腺苷含量達(dá)到10.80 mg/kg，與廣西玉林蟬花含量（11.331 mg/kg）接近[9]。甘露醇作為一種滲透性脫水利尿劑，在臨床中得到了廣泛的應(yīng)用，它具有脫水、清除氧自由基、降低血黏度、改善微循環(huán)等作用[10]。甘露醇的含量為5.13%，較杭州蟬花高（2.18%）[11];從蟬花中共檢測到16種氨基酸，總含量為22.26%，遠(yuǎn)高于浙江湖州蟬花（9.61%）[12]。其中蛋氨酸和谷

氨酸含量較高，分別為3.07%和2.09%。含有除色氨酸以外所有的必需氨基酸。梁平蟬花各活性物質(zhì)含量與其他地區(qū)蟬花相比具有明顯的差異性，可能是由于蟬花菌種的差異性以及特異的環(huán)境影響所造成的，這與張傳博等[4]不同菌種的藥理作用及生物活性物質(zhì)含量差異明顯的觀點(diǎn)一致。

梁平地區(qū)蟬花腺苷和甘露醇含量較高，氨基酸種類多樣，具有較高的藥理作用和營養(yǎng)價(jià)值，可以對(duì)其天然資源進(jìn)行開發(fā)利用。此外，還可以充分挖掘蟬花資源的潛力和價(jià)值，如蟬花其他藥理作用研究、蟬擬青霉菌株液體發(fā)酵生產(chǎn)生物活性物質(zhì)研究、人工栽培蟬花研究等。

參考文獻(xiàn)

[1]

陳玲，宋捷民.蟬花的研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥科技，2009，16（2）：159-160.

[2] 蔣寧，高大偉，林金盛，等.蟬花的研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：11-14.

[3] 劉愛英. 中國蟬花資源研究應(yīng)用[M]. 貴陽：貴州科技出版社， 2012.

[4] 張傳博，王艷麗，易萌，等.江蘇省天王鎮(zhèn)磨盤山金蟬花分離菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（15）：152-154，238.

[5] 彭瑛，郭丹釗，劉任糠，等.超聲波輔助蟬花多糖提取工藝優(yōu)化研究[J].輕工科技，2017，33（6）：16-17，114.

[6] 葛飛，夏成潤，李春如，等.蟬擬青霉菌絲體與天然蟬花中化學(xué)成分的比較分析[J].菌物學(xué)報(bào)，2007，26（1）：68-75.

[7] 李鋒.DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）在真核生物中的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（24）：137-139.

[8] 路暢，黃銀花.動(dòng)物長鏈非編碼RNA研究進(jìn)展[J].遺傳，2017，39（11）：1054-1065.

[9] 張洪梅，史曉颯，劉騰飛，等.不同產(chǎn)地蟬花中腺苷、蟲草素和麥角甾醇的含量比較[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2017，10（3）：297-301.

[10] 鐘健.淺析甘露醇在臨床中的應(yīng)用[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志，2017，5（17）：2-3.

[11] 阮桂平，彭拓華.冬蟲夏草及其類似品中甘露醇的含量研究概況[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，13（2）：96-97.

[12] 滕曄，官宗華，宋玉良.野生蟬花與人工培養(yǎng)品中氨基酸、無機(jī)元素成分的比較[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（10）：1123-1125，1127.