木薯及其同源四倍體基因組與DNA甲基化差異分析

肖亮 周慧文 謝向譽 尚小紅 陳松筆 嚴華兵

摘 要 為研究染色體加倍對木薯基因組的影響，以及多倍化與2種不同倍性木薯之間DNA堿基序列的變化的聯系。本研究以木薯品種“新選048”二倍體及其同源四倍體為研究材料，使用微衛星（simple sequence repeat， SSR）、目標起始密碼子多態性（stand codon targeted polymorphism， SCoT）和甲基化敏感擴增多態性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術分別對木薯倍性間的遺傳差異、DNA甲基化水平和模式進行分析。結果表明：利用SCoT和SSR均未檢測出多態性條帶產生，利用MSAP技術可檢測出在DNA甲基化水平和模式均發生較大改變。二倍體和同源四倍體的總甲基化率分別為60.21%、59.52%，全甲基化率分別為39.92%、41.42%，半甲基化率分別為20.29%、18.10%。木薯多倍化后，其中有27.30%的位點發生了過甲基化，四倍體有25.00%的位點表現出去甲基化。本研究結果為探究木薯倍性間遺傳差異和表觀遺傳變化規律進行了前期探索。

關鍵詞 木薯；二倍體；同源四倍體；DNA甲基化；遺傳差異

中圖分類號 S533 文獻標識碼 A

Abstract To study the effect of chromosome doubling in cassava genome and， explore the relationship between changes of DNA sequence in two different ploidy levels and polyploidization variation in cassava， the cassava variety ‘Xinxuan 048 and its autotetraploid were taken as the materials to analyze the genomic mutation and DNA methylation diversity using microsatellite （Simple Sequence Repeat， SSR） and Stand codon targeted polymorphism （SCoT） molecular marker and Methylation Sensitive Amplification Polymorphism （MSAP） technique. The results showed that no polymorphic band occurred using SCoT and SSR molecular marker. In the level of DNA methylation，both of the level and pattern of the autotetraploid cassava changed. The total methylation rate of the diploid and the autotetraploid was 60.21% and 59.52%， respectively；the full methylation rate was 39.92% and 41.42%， respectively；the hemi methylation rate was 20.29% and 18.10%， respectively. In comparison to the diploid， the pattern of the methylation showed that about 25.00% sites was demethylation， 30.63% sites has been methylated in autotetraploid cassava. This research is a foundation for the further exploration of genetic differences and epigenetic regulation after cassava polyploidization.

Key words cassava； diploid； autotetraploid； DNA methylation； genetic differences

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）（2n=36）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，是熱帶地區第三大糧食作物，全球第六大糧食作物，被譽為“淀粉之王”，是世界近6億人賴以生存的糧食。除此之外，木薯還可飼用和加工成各種工業產品，如淀粉、酒精等[1]。因此，高產穩產和特色優質木薯品種選育顯得尤為必要[2]。

染色體多倍化在植物進化過程中頻繁發生，對于產生新物種貢獻很大。同源四倍體植株能在細胞學、生理生化及表型方面發生顯著變化[3]。木薯為無性繁殖作物，基因組高度雜合，人工誘導多倍體是木薯種質創新的理想途徑[4]。伴隨著同源多倍化，植物在基因組和表觀遺傳等水平都發生了顯著變化，如染色體重組、DNA序列消除、DNA甲基化等[5]。

分子標記技術是目前研究上述領域的有效方法之一。梁武軍等[6]和鐘鳴等[7]利用簡單重復序列（simple sequence repeat， SSR）鑒定葡萄柚（Citrus paradisi Macf）后代和柳枝稷（Panicum virgatum）的遺傳多樣性。韓國輝等[8]和周慧文等[9]分別利用目標起始密碼子多態性分子標記（start condon targeted polymorphism，SCoT）分析枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）和木薯的遺傳多樣性。然而，目前利用SSR和SCoT技術對不同倍性木薯間遺傳差異的相關研究卻鮮見報道。

植物中甲基化位點包括3種：CG、CHH和CHG（H表示除G以外的核苷酸）[10]。李雅婷等[11]曾利用甲基化敏感擴增多態性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術研究發現鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）同源四倍體有28.63%的位點發生了去甲基化，30.63%的位點發生了過甲基化。王紅娟等[12]以20對引物研究了二倍體與同源四倍體茅蒼術（Rhizoma Areactylodis Lanceae）的甲基化差異的擴增總甲基化率為56.92%和55.03%，四倍體基因組DNA半甲基化率高于二倍體，而全甲基化率低于二倍體；四倍體與二倍體相比，DNA甲基化模式發生調整的基因位點占總檢測位點的52.53%。

本研究利用SSR和SCoT技術分析木薯品種“新選048”二倍體及其同源四倍體間的遺傳差異，并利用MSAP技術探究木薯二倍體與同源四倍體的DNA甲基化水平與模式的變化，旨在探究木薯倍性間DNA堿基序列變化與木薯同源多倍化之間的聯系以及為揭示木薯不同倍性間甲基化變異趨勢奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究在廣西大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室進行，供試的木薯品種“新選048”二倍體親本由廣西農業科學院經濟作物研究所提供。其同源四倍體由本課題組前期使用秋水仙素加倍該品種獲得[13]。

19條SCoT引物序列參照嚴華兵等[14]文中所列（表1），36對SSR引物參照王明等[15]文中所列（表2）。MSAP接頭序列與引物序列見表3。

1.2 方法

1.2.1 材料獲得 將二倍體親本及其同源四倍體的6個不同株系的組培苗種植于溫室大棚內，取葉片用于分子標記分析；在同源四倍體中挑選一個株系，待莖稈成熟后，將莖稈砍成20 cm一段的稈扦插至盆中，2個月后取二倍體和四倍體的頂端嫩葉，用于甲基化分析。

1.2.2 木薯全基因組DNA提取 使用常規CTAB法提取其DNA。將提取好的DNA稀釋成60 ng/μL濃度，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 SSR標記擴增與檢測 PCR擴增體系與程序參照王明等[15]。SSR擴增產物均用7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，以恒定電壓600 V跑膠20 min。電泳結束后用1 g/L AgNO3染色8～10 min，顯影后拍照保存。

1.2.4 SCoT標記擴增與檢測 PCR擴增體系與程序參照相關文獻[14]。擴增反應結束后，取5 μL擴增產物，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳、GoldView核酸染色劑染色后在紫外凝膠成像系統上拍照保存。

1.2.5 MSAP分析 酶切體系完全參照李雅婷等[11]的方法。酶切完畢后，在酶切片段的兩端加上人工設計的與EcoR I和Hpa II/Msp I酶切位點互補的人工接頭（表3）。接頭連接體系為20 μL，其中包含：2 μL 10×T4 Buffer、0.4 μL 20 μmol/L EcoR I和Hpa II/Msp I 接頭，其余用水補齊，16 ℃過夜。隨后進行的預擴增和選擇性擴增使用的體系和PCR程序同樣參照李雅婷等[11]的方法。擴增產物經94 ℃變性10 min后于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳，銀染后觀察結果。每份材料擁有2條泳道，為同裂酶HpaⅡ、MspⅠ與EcoRⅠ組合進行雙酶切所產生。

參照王春國等[16]的方法，將木薯二倍體與其同源四倍體的DNA甲基化水平變化分為4大類共15個亞類。A類是指在同一位點，二倍體與四倍體的擴增模式未發生改變，即不存在擴增多態性；B類表明在同一位點四倍體表現出過甲基化或超甲基化，即四倍體的甲基化水平較二倍體上調；C類表明四倍體表現出去甲基化，即四倍體較二倍體的甲基化水平下調；D類表明MSAP技術無法確定該位點甲基化狀態調整，但該位點的甲基化模式同樣產生多態性。

1.3 數據處理與分析

在泳道的同一位點處，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，篩選條帶數量豐富，擴增清晰的引物進行條帶數據統計分析。MSAP條帶統計分析方法參考王春國等[16]和邊禹[17]的方法。

2 結果與分析

2.1 木薯二倍體與同源四倍體基因組的遺傳差異

用SSR標記的36對引物對木薯二倍體及其同源四倍體共7份材料進行擴增，部分擴增結果如圖1所示。從圖2中可見，所使用的引物可以在這7份材料中擴增出清晰的條帶。每對引物擴增的條帶數在1～5之間，在7份材料中一共擴增出672條條帶，平均每對引物在每份材料中擴增出2.7條條帶，條帶大小主要集中于250～750 bp之間，但是沒有一條引物可以檢測到有新增位點或者缺失位點。

用19條SCoT分子標記引物對木薯二倍體及其同源四倍體共7份材料進行擴增，部分擴增結果如圖2所示。從圖2中可見，所使用的引物均能在這7份材料中擴增出清晰的條帶。每條引物擴增條帶數在3～12條之間，大多數條帶大小集中在500～3 000 bp之間。19條SCoT引物共擴增出1 008條條帶，平均每條引物在每份材料中擴增出7.6條條帶。但結果同使用SSR分子標記分析倍性間遺傳差異相同，均未發現有多態性條帶產生。雖然條帶有亮有暗，推測可能是由于基因的劑量效應導致，而與堿基序列變化無關。所使用的6份同源四倍體材料與其二倍體親本沒有檢測出新增或缺失位點，即利用SCoT分子標記也未能檢測出木薯倍性間的遺傳差異。

2.2 木薯二倍體與四倍體的MSAP結果

從50個引物組合中篩選出了23個擴增條帶豐富，清晰可辨的引物組合，以這23個引物組合所擴增出的位點進行分析，結果如表4所示。23個引物組合共擴增出1 500個位點，其中，二倍體共擴增出754個位點，同源四倍體共擴增出746個位點。雖然倍性間的總甲基化率幾近持平，四倍體略低于二倍體0.69%，但是甲基化類型發生了變化。同源四倍體雙鏈內甲基化的位點低于二倍體4.84%，單鏈外甲基化的位點低于二倍體2.19%，完全甲基化的位點高于二倍體6.34%。其中，四倍體半甲基化率低于二倍體2.19%，全甲基化率高于二倍體1.5%。由此可見，木薯二倍體與其同源四倍體的總甲基化水平相差較小，但是各個甲基化類型發生了一定規模的改變。從DNA甲基化水平類型看（表5），木薯二倍體及其同源四倍體擴增類型為A類的位點占總擴增位點的43.62%，B類擴增位點數占總數的27.30%。C類的擴增位點數的比例是25.00%，D類擴增條帶比例最小，為4.08%。綜上所述，多態性擴增位點數目占總擴增數目的56.38%，即木薯多倍化后，共有56.38%的位點甲基化模式發生了調整。

H2和M2分別代表木薯二倍體EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切擴增結果。H4和M4代表木薯四倍體EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切擴增結果。箭頭和字母表示不同甲基化擴增模式（與表4對應）。E39Msp59-E44Msp39為不同引物組合。M為marker。

3 討論

木薯為無性繁殖作物，基因組高度雜合，這決定了多倍體育種可作為木薯種質創新的重要途徑[4]。2017年，有報道稱為了滿足人們生活需要，木薯長期的無性繁殖固定了大量的有害突變，同源多倍化產生冗余基因導致顯性基因掩蓋隱性等位基因的有害突變，大大減少了純合隱性突變，降低有害個體發生的頻率；另一方面，同源多倍化還可以通過改變生物體重要基因拷貝數的增加會導致基因功能的多樣化[18]。本研究中利用SCoT和SSR分子標記分析木薯“新選048”二倍體及同源四倍體的DNA堿基序列進行檢測，并未發現木薯二倍體與其同源四倍體間的遺傳差異，這與曾少華[19]對柑橘國慶1號的研究結論一致，原因可能為：（1）選取標記數量太少，如果在全基因組范圍內多挑選一些SSR或許二倍體和四倍體之間能表現出遺傳差異。（2）本研究使用的檢測手段——SSR分子標記和SCoT分子標記具有局限性，未能對木薯二倍體與同源四倍體進行全面檢測。或許更換分子標記種類，如使用AFLP或許可以檢測出遺傳差異。

與通過高通量測序的重亞硫酸鹽處理DNA來檢測全基因組甲基化信息的方法相比，在AFLP分子標記技術上改進的甲基化敏感限制性酶切法（MSAP法）更為經濟實惠，且該方法操作簡便，可在全基因組水平上進行DNA甲基化模式分析[20]，目前已經被廣泛應用于分析植物脅迫處理[21-22]、輻射誘變[23]以及化學方法誘變的DNA甲基化變異中。在本研究中應用MSAP技術分析木薯二倍體與其同源四倍體的甲基化變異時發現，兩個倍性的甲基化水平十分相近，僅相差0.69%，但是有超過一半的位點的甲基化狀態發生了改變，這與王春國等[16]結果相似。

前人研究發現，去甲基化可以引起轉基因擬南芥的表型產生巨大變異[24]，本課題組觀察到經秋水仙素誘導產生的同源四倍體木薯品種“新選048”有葉片變寬圓，葉色深綠，植株變矮和節間距變短現象[13]。根據MSAP甲基化分析結果推測，產生表型變異的原因可能是由于染色體加倍導致基因的“劑量效應”或是DNA甲基化水平和模式改變而引起。

本研究利用SSR與SCoT分子標記技術未能檢測出木薯品種“新選048”二倍體與其同源四倍體之間的基因組差異。利用MSAP技術可檢測出木薯品種“新選048”二倍體與其同源四倍體之間的DNA甲基化水平和模式發生了變化；其中，二倍體的總甲基化水平為60.21%；四倍體的總甲基化水平為59.52%，低于二倍體0.69%；木薯基因組加倍后，有56.38%的位點的甲基化模式發生了變異，其中有27.30%的位點發生了過甲基化，四倍體有25.00%的位點表現出去甲基化，此結論與鐵皮石斛[11]，茅蒼術[12]，水稻[25]，小麥[26]等研究結論基本一致。本研究為揭示木薯多倍化后表觀遺傳調控提供了理論依據。

參考文獻

[1] Balagopalan C. Cassava utilization in food， feed and industry [C]// Hillocks R J，Thresh J M，Bellotti A C （eds）. Cassava： biology， production and utilization. CAB International，2002： 301-318.

[2] 嚴華兵，葉劍秋，李開綿. 中國木薯育種研究進展[J]. 中國農學通報，2015，31（15）：63-70.

[3] Abdoli M，Moieni A，Naghdi Badi H. Morphological，physiological，cytological and phytochemical studies in diploid and colchicine-induced tetraploid plants of Echinacea purpurea（L.）[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2013，35（7）：2 075-2 083.

[4] Yan H ，Lu L，Hershey C，et al. Cassava mutation breeding：current status and trends[J]. Plant Mutation Reports，2013，33（11）：643-645.

[5] Doyle J J，Flagel L E，Paterson A H，et al. Evolutionary genetics of genome merger and doubling in plants[J]. Annual Review of Genetics，2008，42：443-461.

[6] 梁武軍，解凱東，謝宗周，等. 三倍體葡萄柚實生后代多倍體的發掘與SSR遺傳鑒定[J]. 果樹學報，2015，32（1）：13-18.

[7] 鐘 鳴，周思凡，張新全，等. 利用EST-SSR、IT-ISJ分子標記研究四倍體與八倍體柳枝稷的遺傳多樣性[J]. 草業學報，2016，25（10）：113-123.

[8] 韓國輝，汪衛星，向素瓊，等. 不同倍性枇杷SCoT標記技術體系的建立與應用[C]//全國枇杷學術研討會論文（摘要）集. 2011.

[9] 周慧文，單建偉，馮 斗，等. SCoT分子標記技術在木薯遺傳多樣性分析中的應用[J]. 熱帶作物學報，2015，36（8）：1 440-1 444.

[10] Cokus S J，Feng S，Zhang X，et al. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning[J]. Nature，2008，452（7184）：215-219.

[11] 李雅婷，王紅娟，向增旭. 鐵皮石斛同源四倍體與二倍體基因組及甲基化差異分析[J]. 核農學報，2015，29（10）：1 901-1 908.

[12] 王紅娟，巢建國，李雅婷，等. 二倍體與同源四倍體茅蒼術基因組DNA甲基化水平與模式的MSAP分析[J]. 核農學報，2015，29（8）：1 502-1 508.

[13] Zhou H W，Zeng W D，Yan H B. In vitro induction of tetraploids in cassava variety ‘Xinxuan 048 using colchicine[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2016，128（3）：723-729.

[14] 嚴華兵，周慧文，單建偉，等. 木薯SCoT-PCR反應體系優化及引物篩選[J]. 南方農業學報，2016，47（10）：1 648-1 652.

[15] 王 明，肖鑫輝，安飛飛，等. 利用SSR標記分析木薯遺傳多樣性[J]. 熱帶農業科學，2015，35（11）：38-44.

[16] 王春國，古 瑜，陳成彬，等. 不同倍性西瓜基因組DNA甲基化水平與模式的MSAP分析[J]. 分子細胞生物學報，2009（2）：118-126.

[17] 邊 禹. 不同倍性多倍體枇杷基因組變異及其DNA甲基化分析[D]. 重慶：西南大學，2010.

[18] Ramu P，Esuma W，Kawuki R，et al. Cassava haplotype map highlights fixation of deleterious mutations during clonal propagation[J]. Nature Genetics，2017，49（6）：959-963.

[19] 曾少華. 離體加倍創造柑橘多倍體種質及其細胞學和分子鑒定[D]. 武漢：華中農業大學，2005.

[20] 馬浪浪，江 舟，黃小波，等. 植物DNA甲基化調控研究進展[J]. 中國生物工程雜志，2013，33（9）：101-110.

[21] 孫麗芳，胡凱鳳，高樹仁，等. 鹽脅迫誘導玉米苗期DNA甲基化變異的研究[J]. 核農學報，2017，31（4）：627-634.

[22] 朱紅菊，劉文革，趙勝杰，等. NaCl脅迫下二倍體和同源四倍體西瓜幼苗DNA甲基化差異分析[J]. 中國農業科學，2014，47（20）：4 045-4 055.

[23] 趙 倩，王 巍，張 萌，等. 重離子輻射誘導水稻DNA甲基化變化的分析[J]. 核農學報，2016，30（9）：1 665-1 671.

[24] Ronemus M J，Galbiati M，Ticknor C，et al. Demethylation-induced developmental pleiotropy in Arabidopsis[J]. Science，1996，273（5 275）：654-657.

[25] 楊 瓊，李 輝，左欽月，等. 同源四倍體與二倍體水稻基因組及甲基化差異分析[J]. 應用與環境生物學報，2013，19（4）：630-636.

[26] 聶利紅，王延召，孫其信，等. 人工異源六倍體小麥中甲基化差異的MSAP分析[J]. 華北農學報，2012，27（2）：77-80.