木薯sRNA測序分析及其開花相關microRNA的挖掘

叢漢卿 龍婭麗 王榮香 孫化鵬

摘? 要? 為研究木薯花序與葉片中sRNA表達特性，探索microRNA對其開花過程的調控。本研究以木薯品種“華南八號”花序和幼葉為材料，利用RNA-seq技術進行sRNA測序分析;并篩選開花相關microRNAs進行表達特性分析。從花序和幼葉測序結果中分別獲得12 092 109條和11 499 655條sRNA序列?；ㄐ蛑泻Y選出139條已知microRNAs和253條新預測microRNA，分別預測得到992和3 736條靶基因;幼葉中篩選出134條已知microRNA和191條新預測microRNAs，分別預測得到979和2 603條靶基因。最終篩選出8種與開花調控相關和3種花色調控相關的microRNAs。表達分析顯示，miRNAs在兩樣品間呈現出較大的整體性差異，并且在功能與代謝通路上也不盡相同;開花相關microRNAs中表達差異較大的為miR156、miR172和miR169，其中miR156表達量在花序中高于幼葉，而miR172表達量在花序中低于幼葉，推測其功能為抑制后續的開花過程，避免過度開花。本研究分析了木薯花序與幼葉中sRNA的整體特性，通過表達差異分析初步明確了microRNAs對木薯開花的調控，為進一步深入探索奠定了基礎。

關鍵詞? 木薯;sRNA;microRNA;開花;表達特性中圖分類號? S533???? 文獻標識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.015

木薯（Manihot esculentaCrantz）是世界三大薯類作物之一，也是第四大糧食作物，原產地為南美洲，屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（ManihotP. Miller）^[1-2]。木薯的主產區位于熱帶和亞熱帶地區^[3]。木薯在中國廣東、廣西、云南等主產區不能正常開花結果以獲得成熟的木薯種子，從而無法在當地實現木薯雜交育種工作，其原因在于當地的氣候條件，因此目前中國木薯雜交育種工作僅限在海南島開展，而如廣西地區種植的品種主要依賴從國外或海南等地引進，且品種單一、部分品種已開始退化^[4]。因此，海南以外木薯主產區無法進行雜交育種的問題，已成為中國木薯產業發展的重大課題之一，木薯開花問題的研究就顯得尤為關鍵。研究和利用木薯開花信號途徑中關鍵調控因子的調控特性，是利用生物技術解決這一問題的有力支撐。

MicroRNAs，又稱為miRNAs，長度為20～24個堿基的非編碼單鏈小RNA。通過堿基互補配對原則特異地結合在靶基因mRNA上，在轉錄后水平抑制或降解基因的表達，是一種負調控因子^[5]。miRNAs廣泛參與植物發育過程，例如植物器官的形態建成、激素應答、逆境脅迫與營養代謝、phasiRNAs和自身代謝的反饋調節等功能^[6]。開花作為植物從營養生長向生殖生長轉變的重要事件^[7]，受一系列復雜的內源和外源信號途徑所組成的網絡所調控。miRNAs在這一網絡中，處于相當關鍵的位置，參與了從時期轉變到花芽形成再到花器官分化的整個過程。

對木薯sRNA的研究，前人已有很多相關報道，涉及miRNAs的挖掘^[8]、ta-siRNAs和順式- siRNAs對白葉枯病的響應^[9]、非生物脅迫下miRNA的表達^[10]、miRNA對木薯淀粉合成的影響^[11]以及在木薯不同組織中miRNA的篩選與表達^[12]，然而至今尚沒有對于木薯開花相關miRNAs的針對性研究報道。本研究通過對木薯品種“華南八號”的花序和幼葉sRNA測序數據的對比分析，對木薯的sRNAs序列進行了分類注釋;獲得了大量的miRNA及其靶基因;并挖掘了開花相關miRNA，根據其在兩樣品間的表達特性差異，初步明確了其對木薯開花的調控過程。本研究旨在通過木薯開花相關miRNAs的挖掘和表達分析，明確有哪些miRNAs參與了開花過程，并初步確定其表達特性。為進一步探索木薯的開花調控過程，及miRNAs如何在其中發揮相應的調控功能奠定基礎，并對后續利用分子手段研究和解決除海南外其他中國木薯主產區的開花問題提供理論支持。

1? 材料與方法

1.1? 材料及預處理

實驗材料為木薯品種“華南八號”，2014年9月栽培于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所木薯中心實驗基地。挑選生長發育良好、生長趨勢均一、花序發育初期的植株。分別采集完整花序與幼葉，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取? 分別將兩組樣品液氮研磨后，使用Axygen總RNA小量制備試劑盒（Axygen）分別提取幼葉與花序樣品的總RNA，操作步驟參照試劑盒說明書。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，并用核酸蛋白分析儀DU800（Beckman Coulter）檢測濃度和純度。

1.2.2? sRNA測序? 花序和幼葉樣品的總RNA，送至深圳華大基因（BGI）分別進行sRNA測序，參考基因組為JGI的木薯基因組數據庫（http：// phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias= Org_Mesculenta_er）^[13]。

2.5? 靶基因預測

利用psRobot和TargetFinder工作對已知和新預測miRNAs進行了靶基因預測，我們發現，雖然已知miRNAs和新預測miRNAs的數目相差不大，但二者靶基因數目卻有較大的差距（表3）。新預測miRNAs的靶基因數遠多于已知miRNAs，因此新預測miRNAs有更多的未知功能值得探究。

2.6? 開花相關miRNAs的篩選與分析

通過參考前期文獻的報道，篩選出9種與開花相關的miRNAs（表4）。其中8種為開花調控相關，分別為miR156/157、miR159、miR164、miR165/166、miR167、miR169、miR172和miR319a，涉及調節生物生長時期轉變、開花時間及花器官發育等功能;3類與花色相關，可調控花青素合成相關基因，分別為miR156/157、miR165/166、miR828。其中156家族與165/166家族具有雙重功能，既可以調控花的生長發育，又可調控花青素的合成，從而進一步影響花色。從靶基因預測結果顯示這些miRNA都具有不同數目的靶基因位點，miR156/157較多，具有76個，而miR165/166較少，僅為8個。

從上述開花相關的miRNAs中挑選出較為典型的幾個成員進行表達差異分析（圖5），表達差異較大（≥2倍）的為miR156、miR172和miR169，其余成員差異并不顯著。

花序中miR156表達量遠遠大于幼葉，約為34倍。高表達的miR156可抑制SPL家族轉錄因子，抑制了植物從營養生長轉向生殖生長期。miR172幼葉中的表達量約為花序中的3.7倍。花發育之前，miR172的靶基因——AP2基因家族成員可以抑制開花，花發育開始后，其又會參與調節分生組織的形成和器官生成。miR169在花序中表達量明顯大于幼葉中，約為5.6倍。

表達差異并不顯著的miRNAs中，miR159在兩樣品中表達水平基本一致;miR164在花序中略大于幼葉，約1.86倍;miR166在兩者中都具有較高的表達水平，reads數皆大于30×10⁴，花序略大于幼葉，約1.35倍，因為miR166除可影響花器官極性外，還可調控葉片的極性、莖尖和側面的分生組織的形成、導管的發育等，所以在2個樣品中都有較高表達量;miR167的2個成員部分基本一致，葉片中含量約為花序中的1.29倍，其靶基因ARF家族作為生長素響應因子，在植物體內廣有分布;miR319的reads數，在花序中50條，幼葉中31條，表達量較低，差異不夠顯著。miR319家族的序列與miR159很類似，但其靶基因除了TCP外，還可調控相關MYB轉錄因子，木薯中較低的表達量，是否說明其功能與159有冗余，還需進一步驗證。此外，可參與花青素合成調控的miR828，因測序所獲得的reads數極少，花序中3條，幼葉中1條。

3? 討論

sRNA測序數據中，僅有少量低質量序列，說明數據質量較高，可為具體分析提供基礎。另有部分測序reads無法匹配到基因組數據上，可能因為所使用的參考基因組數據不夠完整。sRNA的組成非常復雜，包含有多種非編碼RNA（ncRNA），已知的如miRNA、snRNA、snoRNA和重復序列（repeat）等都具有其獨特的生物學功能。本研究中木薯花序和幼葉中分別有超過70%和80%的sRNAs無法確定其種類和功能，具有進一步挖掘和研究的價值。

本研究發現，木薯花序樣品中miRNA的整體表達數量約為幼葉中的3倍，說明花序中含有更為豐富的miRNA參與開花的調控，較多的數量能夠增強其調控能力，從側面印證了miRNAs在開花調控過程中的作用。兩樣品中新預測的miRNAs共有257個成員，其中部分成員前體具有較為完美的發卡結構，預示其有極大可能為真正的miRNA，結合其預測的靶基因信息，具有一定的后續研究價值。在miRNAs的表達差異方面，根據DEGseq、GO、KEGG分析結果可以看出已知兩樣品的miRNAs和新預測miRNAs在總體表達特征、功能、代謝通路上都具有一定的差異，說明了其器官分布和調控功能的特性。

木薯中具有全部的已有報道的花發育相關miRNAs^[39]，但在可能起調控花色的miRNAs中，缺少miR858^[40]和miR778^[41]，其中miR858調控MYB12，miR778的研究發現過表達會增加花青素含量，沉默表達則基本無影響，說明miR778對花色調控并非起關鍵作用。在金魚草和矮牽牛中，miR169能夠抑制C類基因^[42]，推測木薯花序中的相對高表達的miR169可以維持花的正常發育。差異表達的miRNAs中較為特別的是對植物開花進行負調控的miR156和正調控的miR172，花序中有更高的miR156和更低的miR172含量。已有研究表明，mi156在營養生長時期的表達量顯著高于生殖生長時期^[43]。猜測因花序已經完成了從營養生長向生殖生長的轉變，處于正常的開花進程，高表達的miR156可以抑制植物后續過度開花。花序中相對低的miR172表達量說明AP2類轉錄因子的抑制作用得到了一定的解除，鑒于花的發育已經開始，其主要作用可能為調控花器官的生成，同時也抑制植株過度開花，影響植株正常的生理過程。鑒于miR156和miR172相對較高的表達數量及較為懸殊的表達差異，說明這兩類miRNAs在木薯開花過程中較為活躍，并起著相對重要的作用。

本研究中的花序樣品為處于不同發育時期的雌雄花多種花器官的混合樣品，只能在整體上體現開花相關miRNAs的表達特點，無法特異反映其在不同時期和不同器官中的表達特性。要明確其具體調控過程，需要在開花過程中選擇更密集的時間點，取用更特異的花器官為材料進行測序，并結合相應轉錄組測序中靶基因表達量數據進行關聯分析。本文初步研究了miRNAs在花序和幼葉中的表達差異，為進一步探索miRNAs如何調控木薯的開花奠定了基礎，通過后續研究，可為解決中國除海南以外主產區木薯無法正常開花并進行雜交育種的問題提供思路。

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