煙堿對腹腔感染敗血癥小鼠的保護作用及其機制研究*

賈寶輝，劉寧，陳奕，黃敏，尚明升，杜玉明

（1.鄭州鐵路職業技術學院，河南 鄭州 451460；2.南昌大學第四附屬醫院 重癥醫學科，江西 南昌 330003；3.鄭州大學第一附屬醫院 重癥醫學科，河南 鄭州 450052）

致病菌入侵機體時，體內的迷走神經釋放遞質乙酰膽堿與免疫系統相互作用參與抗炎，即膽堿能抗炎通路[1]。煙堿是煙堿型乙酰膽堿受體α-7亞基（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7AchR）特異性激動劑，通過與α7AchR結合，比乙酰膽堿抗炎效應更強[2]。本研究應用煙堿激活膽堿能抗炎通路，觀察其對敗血癥小鼠生存率、敗血癥嚴重程度，以及肝、肺組織病理學、血漿促炎癥細胞因子水平的影響，探討煙堿對敗血癥的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康昆明小鼠，雌性，體重20～25 g（南昌大學醫學院實驗動物中心提供）。采用盲腸結扎并穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法復制敗血癥動物模型。65只小鼠隨機分為對照組（15只）、CLP組（20只）和煙堿400μg/kg組（30只），用于觀察生存率和記錄平均生存時間。另取18只小鼠分組同上，每組6只，用于觀察一般狀況，20 h處死動物記錄大體形態學，計算肺濕干重比、敗血癥嚴重程度評分，取肝、肺組織行病理學檢查。另取120只小鼠隨機分為對照組、CLP組，以及煙堿400、200和40μg/kg組，每組24只，用于測定血漿促炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）水平。模型復制成功后，立即腹腔注射不同濃度煙堿或等量生理鹽水，之后每隔8 h追加注入，連續3 d共9次。

1.2 小鼠敗血癥模型的復制

參考文獻[3]復制敗血癥小鼠模型。術前禁食12 h，腹腔注射7%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉。于左下腹做長約1.5cm切口，游離腸系膜和盲腸，以4號絲線環行結扎盲腸根部，用12號針頭于距盲端1cm處貫通穿刺，擠出糞便少許，還納腸系膜和腸管。逐層縫合關腹，碘伏消毒傷口。術畢皮下注射生理鹽水3 ml/100 g，并肌內注射青霉素2萬u預防切口感染。對照組除開腹、游離并還納腸系膜及盲腸、縫合關腹外，不行CLP，其余處理同CLP組。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 生存率記錄對照組、CLP組和煙堿400μg/kg組小鼠24、36和48 h存活例數及生存率。共觀察7 d。

1.3.2 肺濕干重比CLP后20 h處死動物，分離雙側肺組織，取右側肺組織于紗布上吸凈血液，稱濕重后于65℃烤箱中24 h至恒重，稱干重，計算肺濕干重比。

1.3.3 敗血癥嚴重程度評分小鼠CLP后敗血癥嚴重程度評分采用改良的評定標準[4]進行。從一般情況、腸管情況、腹水情況、結扎盲腸情況、病灶包裹情況、肝臟體積及肺濕干重比7個方面進行評定。見表1。

1.3.4 病理學檢查CLP后20 h取肝、肺組織經4%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色后普通光學顯微鏡下觀察。

表1 小鼠CLP后敗血癥嚴重程度評分標準

1.3.5 酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）采用 ELISA 測定血漿 TNF-α、IL-1β的濃度。于CLP術后1、2、4和6 h處死動物，摘眼球取血，經離心后獲得血漿。TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。使用CurveExpert 1.3軟件繪制標準曲線并計算出待測樣品濃度值，以pg/ml表示。每個待測樣品及標準品均作復孔。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，方差分析的兩兩比較用SNK-q檢驗，用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生存率比較

實驗觀察7 d對照組15只小鼠無一例死亡；CLP組20只小鼠術后24、36和48 h分別存活8、5和4只，生存率分別為40.0%、25.0%和20.0%；煙堿400μg/kg組30只小鼠術后24、36和48 h分別存活24、19和17只，生存率分別為80.0%、63.3%和56.7%。煙堿400μg/kg組與CLP組的生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.599，P=0.003），煙堿400μg/kg組生存率高于CLP組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3組小鼠生存率曲線

2.2 肺濕干重比

對照組、CLP組、煙堿400μg/kg組小鼠肺濕干重比分別為（2.71±1.58）、（5.10±0.39）和（2.30±1.03），經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=25.867，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，CLP組20 h肺濕干重比高于對照組（P＜0.05）；煙堿400μg/kg組20 h肺濕干重比低于CLP組（P＜0.05）。

2.3 敗血癥嚴重程度評分

對照組、CLP組、煙堿400μg/kg組小鼠敗血癥嚴重程度評分分別為（6.47±0.74）、（21.00±2.37）和（15.00±3.58）分，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=28.760，P=0.000）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，煙堿400μg/kg組20 h敗血癥嚴重程度評分低于 CLP 組（P＜0.05）。

2.4 病理學變化

2.4.1 肝組織對照組肝細胞結構完整，肝小葉形態正常，肝血竇無擴張和炎癥細胞浸潤。CLP組肝細胞濁腫、脂肪變性，可見灶性壞死，中性粒細胞浸潤明顯（見圖2A）。煙堿400μg/kg組肝細胞未見明顯濁腫，有輕度脂肪變性，未見有壞死灶。中性粒細胞浸潤程度較輕（見圖2B）。

2.4.2 肺組織對照組肺泡上皮細胞形態正常，肺間隔未見增寬，毛細血管無充血和淤血，肺間質未見出血、水腫及炎癥細胞浸潤，肺泡大小均勻，結構完整。CLP組肺泡結構改變，間隔疏松增寬，肺泡內毛細血管明顯充血，可見微血栓形成，肺間質水腫，炎癥細胞浸潤明顯（見圖3A）。煙堿400μg/kg組肺泡結構改變不明顯，未見毛細血管充血，肺間質輕度水腫，炎癥細胞浸潤較輕（見圖3B）。

圖2 兩組肝組織病理結果 （HE×200）

圖3 兩組肺組織病理結果 （HE×200）

2.5 血漿TNF-α濃度

術后1、2、4和6 h對照組、CLP組，以及煙堿400、200和40μg/kg組血漿TNF-α濃度比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的血漿TNF-α濃度有差別（F=41.439，P=0.000）。②5組血漿TNF-α濃度有差別（F=79.356，P=0.000）。術后2、4和6 h時，CLP組較對照組血漿TNF-α濃度升高（P＜0.05），煙堿400、200和 40μg/kg組較CLP組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；6 h時煙堿400μg/kg組較200μg/kg組TNF-α濃度降低（P＜0.05）；2和6 h時，煙堿400μg/kg組較40μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；2和4 h時，煙堿200μg/kg較40μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）。③5組間血漿TNF-α濃度變化趨勢有差異（F=44.172，P=0.000）。見表2和圖4。

表2 各組小鼠不同時間點血漿TNF-α濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

表2 各組小鼠不同時間點血漿TNF-α濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

組別 1 h 2 h 4 h 6 h對照組 242.06±9.64 260.02±19.75 245.74±12.60 256.53±14.82 CLP 組 248.89±10.76 435.26±20.91 869.76±24.61 731.11±42.56煙堿 400μg/kg 組 252.66±11.61 351.24±25.63 680.94±29.09 531.79±8.14煙堿 200μg/kg組 237.90±10.49 360.77±31.96 646.80±18.78 561.63±20.53煙堿 40μg/kg組 236.75±14.44 389.13±11.21 709.53±50.33 589.54±24.27

2.6 血漿IL-1β濃度

術后1、2、4和6 h對照組、CLP組，以及煙堿400、200和40μg/kg組血漿IL-1β濃度比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的血漿IL-1β濃度有差別（F=53.692，P=0.000）。②5組血漿IL-1β濃度有差別（F=78.062，P=0.000）。術后1、2、4和6 h時，CLP組較對照組血漿TNF-α濃度升高（P＜0.05）；術后1、2、4和6 h時，煙堿400μg/kg組較CLP組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；術后 1、4和 6 h時，煙堿 200μg/kg組較 CLP組血漿 TNF-α 濃度降低（P＜0.05）；術后1和6 h時，煙堿40μg/kg組較CLP組血漿 TNF-α 濃 度 降 低（P＜0.05）；4 h時 煙 堿400μg/kg組較200μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；2和 6 h時，煙堿 400μg/kg組較40μg/kg組血漿 TNF-α 濃度降低（P＜0.05）；4 h時，煙堿200μg/kg較40μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）。③5組間血漿TNF-α濃度變化趨勢有差異（F=11.758，P=0.000）。見表3和圖5。

圖4 各組小鼠不同時間點血漿TNF-α濃度變化趨勢

表3 各組小鼠不同時間點血漿IL-1β濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

表3 各組小鼠不同時間點血漿IL-1β濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

組別 1 h 2 h 4 h 6 h對照組 267.34±27.10 261.23±29.13 221.95±30.45 245.19±35.03 CLP 組 327.63±21.27 337.63±19.50 456.17±7.08 556.12±7.08煙堿 400μg/kg 組 272.60±13.94 305.99±14.44 384.75±20.81 245.19±35.03煙堿 200μg/kg組 278.75±12.86 311.68±4.22 421.27±15.64 263.93±17.11煙堿 40μg/kg組 290.06±5.23 314.66±6.27 432.92±16.67 254.92±16.36

圖5 各組小鼠不同時間點血漿IL-1β濃度變化趨勢

3 討論

神經-免疫調節通路在針對機體感染、創傷或缺血、缺氧等損害性刺激，而產生保護性防御反應方面，起非常重要的作用。中樞神經系統通過激活傳出迷走神經纖維，釋放神經遞質乙酰膽堿，與各種免疫細胞上的α7AchR結合，抑制炎癥細胞因子的合成，增加抗炎癥細胞因子的合成，調節外周炎癥反應，從而維持免疫穩定。

體外培養的人巨噬細胞中加入乙酰膽堿，能夠明顯抑制TNF-α的合成，并且電刺激小鼠迷走神經能減輕內毒素血癥時全身性炎癥反應。已知外周血單核細胞上存在的M和N 2種乙酰膽堿受體中，N受體與乙酰膽堿結合后，可抑制TNF-α的合成，即膽堿能抗炎通路主要是通過N受體的激活來實現[6]。共聚焦顯微鏡技術和逆轉錄PCR發現，膽堿能神經系統與天然免疫系統密切聯系的分子基礎在于巨噬細胞等免疫細胞上的N型α-銀環蛇毒素敏感的乙酰膽堿受體（α7亞基）。把人巨噬細胞暴露于煙堿或乙酰膽堿后，可抑制TNF-α、IL-1和IL-18的釋放。迷走神經的感覺神經元上存在IL-1受體，IL-1與其結合后，刺激傳出迷走神經釋放乙酰膽堿，乙酰膽堿與巨噬細胞上的α7亞基結合，從而抑制炎癥細胞因子產生[7]。

學者通過對膽堿能抗炎通路結構基礎的研究，陸續發現激活該通路的各種手段或物質。在經左冠狀動脈前降支結扎-開放法復制的大鼠心肌缺血再灌注損傷模型上，筆者觀察到應用煙堿可減輕心肌細胞損傷，減少缺血面積，保護心肌組織。其機制在于煙堿激活膽堿能抗炎通路，降低體內炎癥細胞因子水平[8]。

煙堿激活膽堿能抗炎通路對感染性休克保護作用的研究較少。已證實刺激內毒素休克大鼠傳出迷走神經，可以減緩低血壓性休克的發生時相，阻止血壓進行性下降，增加體內抗炎癥細胞因子的釋放，降低主要臟器組織和血漿中TNF-α含量。若迷走神經切斷則明顯加重TNF-α對炎癥刺激的反應，使動物對內毒素的致死效應更加敏感。CLP法更接近于臨床上急性腸穿孔或彌漫性腹膜炎所導致的敗血癥/感染性休克的病理生理過程。本實驗前期采用CLP法復制敗血癥動物模型，觀察到腹腔感染敗血癥小鼠肝、肺組織病理損傷嚴重[9]。本研究探討煙堿對CLP敗血癥動物生存率、一般狀況、敗血癥嚴重程度、重要臟器組織病理學的影響，證實煙堿能提高腹腔感染敗血癥小鼠的存活率，延長其生存時間，降低敗血癥嚴重程度的評分，減輕組織器官的病理損害。因此，煙堿對敗血癥動物具有保護作用。

本研究結果進一步表明，敗血癥小鼠血漿中TNF-α和IL-1濃度升高，肝、肺組織炎癥病理改變明顯。而給予煙堿后，血漿中TNF-α和IL-1含量降低，肝、肺組織炎癥病理改變減輕，表明煙堿可減輕敗血癥時的全身性炎癥反應，并具有保護肝、肺功能的作用。其機制可能是煙堿激活迷走神經后，釋放大量乙酰膽堿，與存在于肝Kupffer細胞、單核細胞上的乙酰膽堿受體α7亞基結合，通過一系列途徑阻止Kupffer細胞和單核細胞釋放TNF-α和IL-1，從而拮抗肝臟組織乃至全身性的炎癥反應，與ZABRODSKII等[10]的研究結果一致。

因此，煙堿對敗血癥動物保護作用的機制在于抑制炎癥細胞因子TNF-α和IL-1的釋放，即煙堿具有抗炎效應。并且，這種保護作用及其拮抗炎癥介質的效應，可能與其劑量有一定的相關性。

膽堿能性抗炎通路的發現，使煙堿這一存在于煙草中，長期以來一直被人們認為有毒的物質得以重新評價。適量應用煙堿可能有助于臨床上積極防治敗血癥/感染性休克。未來應當進一步研究煙堿對調控炎癥介質的上游信號分子，如核因子-кB、Toll樣受體等的影響，從分子水平上闡述受體與藥物分子相互作用的機制，開發出激活膽堿能抗炎通路，特別是針對α7AchR的新藥。

參 考 文 獻：

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