EGFR TKIs聯合化療的給藥順序對NSCLC細胞促凋亡的影響

高峰，張澤峰，王濤，王瑞

（河北醫科大學第四醫院 胸外一科，河北 石家莊 050011）

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細胞具有對EGFR絡氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）高度敏感的反應特性[1]。由于患者對EGFR TKIs具有極高的耐受性，以及其對無進展生存期的顯著改善，一線應用EGFR TKIs成為晚期NSCLC患者的標準化治療方案[2-3]，但是患者在接受9～13個月的EGFR TKIs治療后，開始出現獲得性TKIs耐藥[4-5]。持續用藥后難以回避的耐藥成為制約TKIs應用的最大瓶頸[6]。根據實體瘤療效評價標準，腫瘤耐藥后，繼續應用EGFR TKI單藥或者聯合其他治療方式依舊值得考慮[7]，為此，本文探究EGFR TKIs聯合化療的不同給藥方案對NSCLC細胞系促凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑

EGFR突變的NSCLC細胞系：PC9（19號外顯子突變）、H1975（L858R+T790M突變）、HCC827（19號外顯子突變）和HCC827GR（19號外顯子突變+cMET擴增）由廣東肺癌研究所饋贈。PC9ER（19號外顯子突變+T790M突變）由鄭州大學醫學科學院臨床藥理研究所饋贈。

厄洛替尼、WZ4002、順鉑和紫杉醇購自武漢永璨生物科技有限公司，溶于DMSO或水（順鉑），小劑量分裝存儲于-20℃冰箱。

1.2 MTS細胞毒性試驗

各細胞系用含10%胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技有限公司）的DMEM高糖培養基（美國HyClone公司）在37℃、5%二氧化碳CO2細胞培養箱（美國Thermo公司Forma Steri-Cult型）中培養。待細胞處于對數生長期時，取96孔細胞培養板，加入100μl/孔含1×104個細胞的完全培養基鋪板，培養 72 h后，PC9、PC9ER、HCC827、HCC827GR 及H1975細胞分別加入順鉑（終濃度為0.01、0.10、1.00和10.00μmol/L）或紫杉醇（終濃度為0.001、0.010和0.100μmol/L），各處理組設置3～6個復孔。藥物處理72 h后，加入20μl/孔MTS復合物（美國Promega公司）繼續培養4 h后顯色。檢測前搖晃培養板10 s，混勻顏色。用酶標儀（美國Bio-TeK公司Elx800型）于490 nm波長處檢測吸光度值。實驗重復3次，結果用Graph Pad Prism軟件進行分析，使用非線性回歸模型對曲線進行擬合。各藥物處理組相對空白對照組減少的細胞數用百分比表示。

1.3 集落形成試驗

待細胞處于對數生長期時，取24孔細胞培養板，加入500μl/孔含1×103個細胞的完全培養基鋪板，不同藥物處理組設置≥2個復孔，實驗重復3遍。7 d后抽棄藥物，更換為完全培養基，使細胞培養增殖。當細胞克隆生長出現差異時，棄培養基，用PBS緩沖液沖洗2次，甲醇固定，0.005%結晶紫（德國默克公司）對細胞核染色后用倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，IX83）拍照。顯微鏡下計數＜50個細胞克隆數，計算集落形成率。集落形成率（%）=（集落數/接種細胞數）×100%。

1.4 Western bolt檢測

將細胞以2×105個/孔鋪于6孔板，1 ml/孔鋪于完全培養基。待其貼壁生長1～2 d后進行相應藥物干預。用PBS緩沖液沖洗3次，使用細胞裂解液進行裂解。使用Bio-Rad蛋白分析儀（美國Bio Rad公司，Hercules）在595 nm波長處測定各組蛋白濃度。將各組蛋白用去離子水平衡后，加入3×蛋白分離緩沖液煮沸5min，-80℃存儲。

取5μl蛋白Marker，以及包含不加藥對照組在內的6組各25μl樣品上樣，進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，然后電轉于PVDF膜。將膜封閉處理以防抗體非特異性結合，4℃一抗孵育過夜。次日，充分洗膜后，加入含辣根過氧化物酶HRP標記的二抗，避光孵育1 h后洗膜，最后暗室曝光，晾干膠片后，掃描。實驗獨立重復3次，采用Image J軟件對灰度值進行分析。

抗體的使用：cPARP、ERK1/2和兔抗IgG HRP-抗體（英國Abcam公司）溶于5% BSA的TBST溶液中，稀釋倍數分別為1∶10 000、1∶3 000和1∶5 000。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR突變細胞系對不同濃度EGFR TKIs和化療藥物的耐受性

為建立藥物細胞毒性梯度，本實驗首先采用順鉑或紫杉醇處理EGFR突變細胞系72 h，采用MTS法檢測細胞活性變化。結果：①當采用順鉑干預時，對照組細胞活力為（1.36±5.92）%，而干預組為（-7.32±6.81）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=2.353，P=0.040）。濃度達 1μmol/L即可對 PC9和PC9ER細胞產生毒性作用。對于其他細胞系，順鉑濃度＞3.3μmol/L才能檢測到細胞毒性（見圖1A）。②當采用紫杉醇對細胞進行干預時，3.3μmol/L濃度下能檢測到細胞毒性，且PC9對紫杉醇最為敏感（見圖1B）。③在集落形成試驗中，筆者同樣對各細胞系進行更長時間的順鉑、紫杉醇和EGFR TKIs干預。順鉑在7 d的集落形成試驗中對受測細胞系產生的細胞毒性與MTS法結果相似（見圖1C）。由于H1975對紫杉醇高度敏感，而無法判斷給藥順序差異對其產生的細胞毒性影響。耐藥細胞系（PC9ER、HCC827GR和H1975）對厄洛替尼高度耐受，但PC9ER對WZ4002卻極為敏感。

總之，對EGFR TKIs敏感和耐藥的PC9、HCC827細胞系在對化療藥物的敏感性上幾乎沒有差別，說明TKI與化療藥物的敏感及耐藥機制并不相同（見圖1A、B）。為了后續試驗，本實驗選擇順鉑干預PC9和其他細胞系的濃度分別為1.0和3.3μmol/L；選取不僅能夠對全系細胞產生細胞毒性且不會導致細胞全部死亡的紫杉醇濃度為3.3μmol/L。對于EGFR TKIs，筆者總結前人和自己的研究結果，選取能夠使敏感和耐受細胞系產生最大細胞毒性差異的厄洛替尼和WZ4002，濃度均為1μmol/L。

2.2 EGFR TKIs和化療不同給藥順序對細胞毒性的影響

為探究EGFR TKIs和化療不同給藥順序對各EGFR突變細胞系的影響，本實驗將藥物單用、聯用，以及順序給藥干預各細胞系7 d，并采用集落形成試驗進行分析。對照組細胞活力為（0.56±1.86）%，而干預組為（-7.06±5.91）%，經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.013，P=0.013），HCC827GR、H1975細胞對順鉑和紫杉醇具有更高的敏感性，特別是在PC9或PC9ER細胞中，厄洛替尼或WZ4002與順鉑或紫杉醇聯用比單用能產生更強的細胞毒性。當EGFR TKIs和化療藥物順序給藥時，在TKI干預前先給予化療比兩者順序顛倒能產生更強的細胞毒性。實際上，在大多數情況下，先TKI后化療的給藥順序完全屏蔽了后者對細胞產生的毒性作用。相似的結果也出現在那些對EGFR TKIs耐藥和特殊的突變抑制劑WZ4002干預的細胞系中。在預實驗中，筆者同樣檢測了聯合用藥時不同的組合時間（4 d或2+2 d）對PC9ER細胞系的影響，結果與6 d或3+3 d的干預時間并無區別。此外，因HCC827細胞系對厄洛替尼太過敏感，聯合用藥時因效果難以評估而將其從后續實驗中剔除。見圖2。

2.3 化療藥物和厄洛替尼聯用對厄洛替尼耐藥模型凋亡的影響

在厄洛替尼耐藥細胞系中研究厄洛替尼和化療藥物同時或順序給藥（6 d或3+3 d）時，細胞裂解蛋白中的細胞凋亡標志物cPARP的表達，以表示細胞凋亡反應率的差異。厄洛替尼本身對PC9ER和HCC827GR的誘導凋亡作用極弱，但在H1975細胞系凋亡相對明顯。順鉑對PC9ER和H1975細胞都有一定的促凋亡作用，而紫杉醇只對后者有促凋亡作用。然而發現僅在HCC827GR細胞中，紫杉醇和厄洛替尼聯用較兩者前后順序使用細胞凋亡率升高。在某些情況下，兩藥同時干預甚至出現細胞凋亡率下降。最顯著的凋亡反應總是出現在先化療藥物處理，后厄洛替尼干預的細胞系中。只有采用先紫杉醇后厄洛替尼的給藥順序干預PC9ER細胞系和先順鉑后厄洛替尼的給藥順序干預HCC827GR細胞系在本質上算唯一的誘導凋亡實驗，而其他的給藥順序只有些許或者毫無促凋亡現象（見圖3）。在預實驗中，筆者對PC9ER細胞系采用不同的藥物干預時間（4 d或2+2 d），發現與6 d和3+3 d的干預時間并無不同。ERK1/2作為內參照來驗證蛋白質是否均勻加載。

圖1 EGFR突變的NSCLC細胞系的MTS細胞毒性試驗結果

圖2 EGFR TKIs和化療藥物對各細胞系增殖的影響

圖3 各處理組細胞裂解蛋白的表達

3 討論

在EGFR突變的NSCLC患者中，對EGFR TKIs的獲得性耐藥是影響其療效發揮的主要限制因素[8-9]。雖然針對獲得性耐藥已提出一些治療策略[10-12]，但目前并無切實可行的公認方案。腫瘤進展后的化療、放療和TKI繼續服用，以及更新藥物的干預是目前的主要治療策略[13]，但有助于醫師在這些治療策略間進行選擇的預測因素極為有限。

本實驗結果表明，TKI聯合順鉑或紫杉醇具有協同作用。由于藥物狹窄的毒性窗和預實驗發現4或6 d的藥物處理時間并無區別，本實驗選擇了唯一的1種藥物濃度和為期6 d的藥物處理時間。有趣的是，對于TKI具有極高耐藥性的細胞系模型中，本實驗檢測到TKI能夠提高化療藥物的細胞毒性。此外，T790M二次突變和cMET擴增作為TKI最常見的耐藥機制，其對藥物的反應性無顯著差異。同樣本實驗取得相似的結果，第1代TKI厄洛替尼與化療聯用的協同作用無論是對野生型還是突變型EGFR均具有親和力。筆者觀察到協同作用背后，第3代突變型EGFR特異性抑制藥物WZ4002對突變型EGFR的抑制作用極為顯著。在TKI聯合化療藥物的協同作用方面，本實驗取得相似的結果。本研究結果表明，如果EGFR TKIs和化療相結合，藥物的給藥順序至關重要。如果先TKI干預，后化療處理，未出現協同作用，但是采取TKI和化療藥物同時或先化療藥物后TKI的給藥順序時，協同作用顯著。本研究的TKI耐藥模型與前人研究的TKI敏感NSCLC模型具有相似的結果，先化療后TKI治療優于其他給藥方式[14]。臨床上，通常給予NSCLC患者周期性化療，同時聯用TKI很可能只在化療第1階段有協同作用[15]。根據本研究結果，針對獲得性EGFR TKIs耐藥，先化療后TKI可能是最為有效的給藥順序。可以推測，先化療后TKI的治療方式可以預先抑制獲得性耐藥的發展。已經證實，患者可同時并發多種耐藥機制，而化療和TKI 2種治療方式的聯用可能阻止更多耐藥情況的發生。

總之，EGFR TKIs結合化療干預EGFR突變的NSCLC細胞系可以產生協同作用，且給藥順序極為關鍵。這種順序給藥策略值得臨床深入探究。

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