染色體核型分析和熒光原位雜交技術對慢性粒細胞性白血病的診治意義

吳莉芳，饒若，王述文，夏夢娟，姚紅霞

（海南省人民醫院 血液病研究室，海南 海口 570311）

慢性粒細胞性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）具有特異性的Ph染色體和/或具有BCR/ABL融合基因[1]。Ph染色體是第9號與第22號染色體相互易位形成，BCR/ABL融合基因是由第9號染色體上的原癌基因與第22號染色體上的BCR基因相互易位形成[2]。根據BCR斷裂點的不同，可形成3種類型的融合基因，分別是m-型、M-型及μ型， 相應翻譯成P190、P210及P230融合蛋白[3]。該文探討染色體核型分析和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）2種方法在CML診治中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2011年7月-2014年12月海南省人民醫院門診及住院CML患者218例。其中，男性126例，女性92例；年齡7～82歲，中位年齡41歲。本研究統計的數據均按標本接收順序收錄，未進行人工篩選取舍。

1.2 方法

1.2.1 骨髓形態學分析將骨髓涂片瑞氏染色，光學顯微鏡下觀察200個細胞分類計數。外周血涂片堿性磷酸酶染色，光學顯微鏡下觀察100個細胞，積分統計，綜合進行FAB分型。將CML患者按照血液病診斷及療效標準[1]劃分為慢性期（chronic myeloid leukemia-chronic phase，CML-CP），加速期（chronic myeloid leukemia-acceleration phase，CML-AP），急變期（chronic myeloid leukemia-blastic phase，CML-BP）。CML患者治療后的骨髓片參照療效標準分為血液學完全緩解（chronic myeloid leukemia-complete response，CML-CR）、部分緩解、未緩解。

1.2.2 染色體核型分析取患者骨髓細胞，采用直接法和24 h短期培養法制備染色體，R顯帶技術進行染色體核型分析。核型異常按人類細胞遺傳學國際命名體制[ISCN（2005）]加以描述。診斷標準為≥3個細胞有一致的染色體丟失，≥2個細胞有同樣的染色體增加或結構異常[4]。剩余細胞懸液保存于-20℃備用。

1.2.3 FISH采用熒光素標記的位點特異性ES探針GLPBCR/GLPABL（中國北京金菩嘉醫療器械有限公司）。按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 圖像掃描用Olympus BX51（日本Olympus公司）熒光顯微鏡在UV/Rhodamine/FITC三色濾光片的激發下觀察熒光雜交信號，每例分析200個細胞，用染色體分析系統VideoTesT-FISH 2.0（俄羅斯VideoTesT公司）進行圖像采集和保存。

1.2.5 圖像分析及結果判讀紅色信號為ABL探針，位于9號染色體。綠色信號為BCR探針，位于22號染色體。當紅色信號與綠色信號重疊時顯示黃色，即為融合信號。正常細胞的信號為2個紅色信號和2個綠色信號，無融合信號。異常細胞信號為：①2個紅色信號、1個綠色信號、1個黃色信號，提示主要斷裂點M-型，產生P210融合蛋白；②1個紅色信號、1個綠色信號、1個黃色信號，提示der（9）存在序列缺失（ABL或ASS基因缺失）；③1個紅色信號、1個綠色信號、2個黃色信號，提示次要斷裂點m-型，產生P190融合蛋白。＞8%細胞出現融合信號（黃色）即判斷為陽性結果。

1.3 統計學方法

數據處理采用SPSS16.0統計軟件，計數資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨髓形態學FAB分型

本研究收集218例CML患者標本，其中CMLCP初 診 94例（43%）；CML-AP 7例（3%）；CMLBP 16例（7%）。CML-CR復查 33例（15%）。68例（31%）復查患者的骨髓片不符合正常骨髓象，也不符合CML-AP和CML-BP骨髓象的特點，將其歸為CML-CP。

2.2 染色體核型分析檢出率

2.2.1 Ph染色體171例CML標本做染色體核型分析，116例檢出ph染色體，檢出率為68%。其中，CML-CP初診、CML-AP、CML-BP、CML-CP復查、CML-CR患者的Ph染色體檢出率分別為80%、100%、85%、60%和28%。

2.2.2 其他異常核型171例CML患者標本中，22例存在其他異常核型。附表列出了18例具有代表性的異常核型，包括除典型9，22易位以外的所有其他染色體結構及數量改變，如變異易位、復雜易位、隱匿易位等。

2.2.3 未檢出171例CML患者標本中，22例標本因分裂相少，質量差，未能找到可分析的分裂相。

2.3 FISH檢出率

218例CML患者標本做FISH，無不可檢測標本，174例檢出BCR/ABL基因，檢出率為80%。其中CML-CP初診、CML-AP、CML-BP、CML-CP復查、CML-CR患者檢出率分別為93%、100%、100%、75%和39%。1例CML-BP患者檢出der（9）部分序列缺失，且產生的融合蛋白類型為P190。

2.4 染色體核型分析與FISH的檢出率比較

FISH對BCR/ABL融合基因的檢出率與染色體核型分析對Ph染色體的檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=7.249，P=0.007），FISH高于染色體核型分析。見附圖。

附表 18例伴有其他核型異常的CML患者

附圖 染色體核型分析與FISH的檢出率比較

3 討論

3.1 染色體核型分析

本研究中，其他異常核型的檢出率占13%，高于謝新等[5]的報道。本實驗在CML的各個分期中均檢出其他異常核型，與吳蔚等[6]的報道一致。本研究發現，在CML-AP和CML-BP患者中，其他異常核型檢出率高于CML-CP初診患者，與謝新等[5]的報道是一致。其他異常核型包括已報道的2Ph，+8，+21及i（17q）[5，7]，也有3條染色體間的復雜易位，如t（9；22；11）（q34；q11；q14）、t（9；9；22）（q21；q34；q11），以及 t（2；9；22）（q14；q34；q11）。

3.2 FISH

本研究發現CML-CP初診患者與CML-AP患者的BCR/ABL融合基因檢出率與文獻的報道一致，CML-BP患者的BCR/ABL融合基因檢出率高于文獻報道，CML-CR患者的BCR/ABL融合基因檢出率低于文獻報道[8]。

CML的BCR/ABL融合基因由主要斷裂點斷裂產生，其蛋白表達產物是P210。RAVANDI等[9]統計＞1 000例CML患者，發現CML斷裂點位于主要斷裂點以外的發生率＜1%，位于次要斷裂點的發生率更小。本研究結果表明，3.00% CML患者BCR/ABL融合基因產生的蛋白類型為P210共表達P190，0.95%CML患者BCR/ABL融合基因產生的蛋白類型為P190。

SINCLAIR等[10]首先發現并報道der（9）部分序列缺失與患者的生存率和疾病進展關系密切，是一項強有力的負性預后因素。本研究發現，18% CML患者存在der（9）部分序列缺失，與吳煒等[11]的報道一致。其中，20% CML-CP、67% CML-AP、33% CML-BP、12% CML-CP復查、10% CML-CR患者存在der（9）部分序列缺失。結果表明，CML-AP和CML-BP的患者更易發生der（9）部分序列缺失，與董潔等[12]的報道一致。

3.3 2種檢測方法比較

171例CML患者標本同時應用染色體核型分析與FISH檢測，其中8例標本（4.6%）的染色體核型分析為正常核型，但BCR/ABL融合基因陽性，提示有隱蔽的BCR/ABL基因重排，與孫川等[7]的發現一致。FISH有助于可疑CML的診斷[13]，在CML的療效監測中具有更好的優勢[14]。

FISH可以通過對探針序列的巧妙設計，不同的信號方式提示更豐富的信息。既可以檢測BCR基因斷裂的位置，又可檢測der（9）的部分序列缺失。但是，往往復雜的信號方式解讀須參考染色體核型分析的結論。

171例染色體核型分析的CML患者標本中，22例標本因分裂相少，質量差，未能找到可分析分裂相。而FISH不受細胞分裂期的影響，可以分析處于各個分裂期的細胞。

染色體核型分析可以發現其他異常核型，能夠全面了解染色體核型情況，但FISH只能檢測BCR/ABL融合基因及其相關序列。

綜上所述，染色體核型分析與FISH 2種遺傳學檢測方法分別提示不同的遺傳信息，兩者聯合應用可為臨床對CML的診斷、用藥及預后提供可靠的依據。

參 考 文 獻：

[1]張之南, 沈悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京：科學出版社, 2007:134-138.

[2]MICHAEL W N, JOHN D, GODMAN M, et al.The molecular biology of chronic myeloid leukemia[J].Blood, 2000, 96(10):3342-3343.

[3]MELO J V.The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype[J].Blood, 1996, 88(7):2375-2384.

[4]薛永權.白血病細胞遺傳學及圖譜[M].天津：天津科學技術出版社, 2003:46-61.

[5]謝新, 過宇, 薛永權.600例慢性粒細胞性白血病的細胞遺傳學分析[J].中華醫學遺傳學雜志, 1998, 15(2):85-88.

[6]吳蔚, 顧健, 馬莉, 等.細胞遺傳學檢測在慢性粒細胞性白血病中的應用價值[J].中華全科醫學, 2015, 13(8):1320-1322.

[7]孫川, 李倩, 林穎, 等.慢性粒細胞性白血病額外染色體異常在加速期和急變期的意義[J].醫學研究雜志, 2014, 43(1):108-110.

[8]張濟, 李君君, 顏家運, 等.熒光原位雜交仔慢性粒細胞性白血病細胞BCR/ABL融合基因檢測中的應用及其意義[J].實用醫學雜志, 2012, 28(5):825-827.

[9]RAVANDI F, CORT ES J, ALBITAR M, et al.Chronic myelogenous leukaemia with p185BCR-A BL expression:characteristics and clini cal significance[J].Br J Haematol, 1999,107:581-586.

[10]SINCLAIR P B, NACHEVA E P, LEVERSHA M, et al.Large deletions at the t (9; 22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroup of patients with chronic myeloid leukemia[J].Blood, 2000, 95:738-744.

[11]吳煒, 薛永權, 吳亞芳, 等.Ph染色體陽性慢性粒細胞白血病衍生9號染色體缺失的FISH研究[J].中華血液學雜志, 2006,27:183-186.

[12]董潔, 李薇, 白晶, 等.9號衍生染色體在慢性粒細胞白血病預后評估中的意義[J].吉林大學學報, 2016, 42(2):301-304.

[13]BACCARANI M, DEININGER M W, ROSTI G, et a1.European leukemia net recommendations for the management of chronic myeloid leukemia, 2013[J].Blood, 2013, 122(6), 872-884.

[14]National Comprehensive Cancer Network.NCCN clinical practice guidelines in oncology, chronic myelogenous leukemia version 2:2014 [S/OL].[2015-03-24].http://www.nccn.org／NCCN GuidelinesTM & Clinical Resources.