46例肥胖者腸道腸桿菌菌群與內毒素的調查研究

孫 麗 張詩海

細菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或細菌內毒素（endotoxin,ET）是革蘭陰性細菌細胞壁上的特有結構，其成分主要是O-特異性鏈、核心多糖和類脂A三部分組成。1～2歲期間腸道菌群基本形成，并在一生當中保存相對穩定[1]。正常菌群的種類、數量和分布是一種動態的相對穩定，受年齡、人種、膳食結構、生活習慣等因素的影響而不同。肥胖癥患者腸道內內毒素產生菌過度增長是否是其肥胖發生的重要原因之一，本文研究如下：

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集2015年1月22日-2016年12月16日本醫院住院病人和門診體檢者的糞便標本30 g。入選標準為BMI＞30和血清內毒素（LPS）的含量大于5 pg/mL（最低檢測下線）的肥胖癥患者。

1.2 內毒素測定 采用MB-80微生物快速動態檢測系統及試劑盒（北京金山川科技發展有限公司），用動態濁度法對患者血清進行檢測。取靜脈血2 mL，離心1000 rpm，l min，制備出待測血清備用。

1.3 糞便細菌菌落計數及培養 稱取0.5 g糞便加入50 mL磷酸鹽緩沖液（PBS)震蕩均勻，其作為10-2稀釋度，再用PBS稀釋到10-10備用，分別取0.1 mL前述備用稀釋液，用涂菌棒涂羊血瓊脂、SS、麥康凱、沙保羅、四號瓊脂，以及腸桿菌顯色培養基。分別做需氧菌、厭氧菌和真菌培養，挑選菌落最清楚的一個濃度計算菌量。每克標本的菌落數(CFU/g)=0.1×適當稀釋級特征菌落數(為3個復樣的均數)×稀釋倍數。

1.4 菌株鑒定 全部菌株均使用Viteck2系統進行鑒定。菌株生化鑒定質控標準菌株為ATCC25922，ATCC25923，ATCC27853，ATCC700603均來購自安徽省臨床檢驗中心。

1.5 大腸埃希菌16SrDNA PCR及電泳 ①挑取大腸埃希菌落放入LB培養液中增菌，富集細菌，用革蘭陰性菌DNA提取試劑盒（北京卓誠惠生生物科技有限公司）。②引物及PCR體系：通用引 物R1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，R2：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’；PCR體系：10 X PCR Buffer (含Mg離 子)5模板DNA 50 ng，用ddH2O補充到50體系。③反應程序：94 ℃，1 min，94 ℃，1 min，50℃，1 min，72℃，1.5 min，30個循環；72 ℃ 2 min，25 ℃，5min，PCR擴增產物1%瓊脂糖電泳檢測。

1.6 內毒素質控 用革蘭陰性菌脂多糖質量控制品（購于北京金山川科技發展有限公司）進行室內質量控制，注意批號的更換時導入新的標準曲線。

1.7 統計學方法 采用Logistic多因素分析LPS所測的值與腸道菌落計數之間的相關性。

2 結 果

2.1 內毒素檢測結果 46例肥胖者腸道菌群血漿標本內毒素含量最高為37.26 pg/mL，最低7.009 pg/mL；以50 pg/mL為陽性臨界值時，血漿內毒素含量檢測均在正常范圍內。

2.2 細菌培養結果 46例肥胖者糞便培養出大腸埃希菌42例（占91%），非大腸埃希菌4例（占9%）。46例肥胖者糞便同時培養出2種腸桿菌的6例（13%），男女各半。42例肥胖者糞便同時培養出大腸埃希菌和腸球菌的2例（4%），男女各1例。42例肥胖者糞便培養出酵母菌的為2例（4%），均為女性。LPS所測的值與腸道菌落計數大小趨勢呈正相關（r=0.93，P＜0.001）。見圖1。

圖1 46例肥胖者糞便LPS值與腸道菌落計數的關系圖

2.3 大腸埃希菌16SrDNA PCR電泳結果 46例肥胖者糞便培養出大腸埃希菌16SrDNA PCR電泳結果顯示，在瓊脂糖相當于Marker的1500bp處出現PCR的擴增產物條帶。見圖2。

圖2 46例肥胖者糞便培養出大腸埃希菌16SrDNA PCR電泳結果

3 討 論

人體腸道菌群(Intestinal nom)棲息著大約30屬細菌，超過1000多種細菌，其總重量大約1.5千克，細菌總數達1012～1014，編碼的基因數量至少是人體自身基因的100倍[2]。腸道細菌在促進食物消化、合成蛋白質和維生素等營養物質、抵御外來致病菌侵入以及增強機體免疫能力等方面有著重要作用。腸道菌群通過多種機制參與機體的能量代謝、維持機體的能量平衡，包括促進腸道微絨毛的生長、不能被消化的膳食纖維等的酵解、肽類或蛋白質的無氧酵解、結合膽汁酸的生物轉化、草酸鹽復合物的降解及一些維生素的合成。

腸道菌群與人體共同進化，為宿主提供其自身不具備的酶和生化代謝通路。腸道菌群通過與人體和外界環境相互作用，影響人體的營養、免疫和代謝[3]。腸道細菌是影響肥胖和脂肪蓄積的環境因素[4]。腸道細菌結構和功能變化引起肥胖部分作用是通過增加吸收食物中的能量實現的，尤其是降解食物中的多糖，基因分析發現，肥胖小鼠腸道細菌富含降解糖類等的能量攝入相關的基因[5]。腸道細菌能合成大量糖苷水解酶，將植物多糖轉變為單糖、短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）、乙酸、丙酸、丁酸。世界衛生組織（WHO）根據BMI 將通常說的“肥胖”分為超重和肥胖兩個層次，超重是指25≤BMI＜30[6]，肥胖是BMI＞30。本次實驗中大腸埃希菌VITEK2鑒定和16SrDNA PCR電泳結果一致，可以認為鑒定結果正確。腸桿菌容易產生內毒素，而腸道中乳酸桿菌和糞便雙歧桿菌等不易產生內毒素，紅酒可以改變菌群分布[7]。

綜上所述，在小鼠實驗中證實[8]由飲食導致的肥胖者其內毒素升高，而本實驗證實其腸道菌群中腸桿菌多是大腸埃希菌為主，輔以陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌和酵母菌，其菌量多少與LPS大小趨勢一致。

參考文獻

[1] Palmer C, Bik EM, DiGiulio DB, et al.Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol,2007,5:26.

[2] Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature,2010,464:59～65.

[3] Neish AS. Microbes in gastrointestinal health and disease. Gastroenterology,2009,136:65～80.

[4] Backhed F, Ding H, Wang T, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc Natl Acad Sci U S A 2004,101:15718～15723.

[5] Turnbaugh PJ, Backhed F, Fulton L, et al. Dietinduced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell Host Microbe,2008,3:213～223.

[6] Obesity: preventing and managing the global epidemic. Report of a WHO consultation: World Health Organ Tech Rep Ser. 2000;894:i-xii,1～253.

[7] Moreno-Indias I, Sanchez-Alcoholado L,Perez-Martinez P, et al. Red wine polyphenols modulate fecal microbiota and reduce markers of the metabolic syndrome in obese patients. Food Funct,2016,7:1775～1787.

[8] Collins KH, Paul HA, Reimer RA, et al.Relationship between inflammation, the gut microbiota, and metabolic osteoarthritis development:studies in a rat model. Osteoarthritis Cartilage,2015,23:1989～1998.