健脾化痰湯對大鼠脂肪肝炎癥及巨噬細胞分化的影響?

薛 欣，李玉梅，李海玉，陳 冰，張立石，馬雅鑾

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種無過量飲酒史，由各種原因引起的肝細胞內脂肪堆積，以肝細胞脂肪變性和脂質蓄積為主要特征的臨床病理綜合征。目前公認的NAFLD發病機制為“二次打擊”學說[1]。“二次打擊”學說表明，炎癥反應在NAFLD發生發展過程中起很重要的作用。近年來的研究表明，脂肪肝組織中存在著慢性炎癥。其特點一是與炎癥反應相關的脂肪因子(adipokine)合成異常[2]；二是急性期反應物增多，如C-反應蛋白(C response protein，CRP)[3]等；三是炎癥信號網絡激活、過度表達促炎性和炎性介質，如白細胞介素(inferleukin，IL)- 6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、細胞間黏附分子(intercellular cell adhesion molecule，ICAM)-1、單核細胞趨化因子(monocyte chemoattractant protein， MCP)-1等[4]；四是肝巨噬細胞(Kuppfer細胞)聚集、極化與NAFLD有密切關系[5-6]。

脾虛生痰是脂肪肝形成的重要病機之一。臨床應用健脾化痰法治療脂肪肝具有較好療效[7-9]。健脾化痰湯(二陳湯與四君子湯的和方)具有健脾、化痰之功效。本研究以高脂飼料聯合脂肪乳灌胃復制大鼠脂肪肝模型，觀察健脾化痰湯對血清C-反應蛋白、肝組織炎癥因子的影響，從巨噬細胞極性的角度探討炎癥在健脾化痰湯防治肝細胞脂肪變性中的作用。

1 材料與方法

1．1 動物

清潔級SD 雄性大鼠40只，體質量(200±20 g)，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供(SCXK(軍)2012-0004)，飼養于中國中醫科學院中醫基礎理論研究所動物實驗中心(為清潔級動物室)。

1．2 藥物和試劑

易善復多烯磷脂酰膽堿膠囊(國藥準字H20059 010)購于賽諾菲安萬特制藥有限公司；脂肪乳(20%豬油，10%膽固醇，2%膽鹽，1%丙基硫氧嘧啶)，其中豬油自備，膽固醇(批號20130626)、膽鹽(批號20120410)、丙基硫氧嘧啶(批號20130307)購于國藥集團化學試劑有限公司；C反應蛋白(CRP) ELISA試劑盒購于南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒購于德國Qiagen公司；實時熒光定量PCR探針GAPDH、MCP1、干擾素γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)由美國Life Technology公司合成；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購于美國ABI公司；7500 Real-time PCR儀為美國ABI公司產品。

1．3 藥物制備

健脾化痰湯的組成：黨參9 g，白術9 g，茯苓9 g，甘草6 g，法半夏15 g，陳皮15 g，生姜3 g，烏梅1枚。所有藥材均購自北京同仁堂藥業股份有限公司，水煎劑濃縮至折合原藥材濃度1.0 g/ml(相當于70 kg成人臨床等效劑量的8倍)。易善復(多烯磷脂酰膽堿)溶液制備：以相當于70 kg成人臨床等效劑量8倍，用蒸餾水溶解制成易善復溶液。脂肪乳的制備：將20%豬油、10%膽固醇、2%膽鹽、1%丙基硫氧嘧啶按比例攪勻。

1．4 方法

1．4．1 分組、造模及給藥 將實驗動物按體質量均衡和隨機原則分為正常對照組、模型組、健脾化痰湯組和易善復組各10只。正常組大鼠給予維持期飼料飼養、自由飲水，模型組和給藥組大鼠均按0.5 ml/只/d的量灌胃脂肪乳,連續造模8周。自造模之日起，健脾化痰湯組給予含生藥1.0 g/ml的濃縮液灌胃，易善復組作為陽性對照藥，以相當于70 kg體質量成人臨床用藥量8倍的量灌胃，各給藥組按1 ml/100 g體質量灌胃，每日1次，連續給藥8周。正常組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃。各組大鼠于造模給藥結束后處死，留取肝組織標本及下腔靜脈取血。

1．4．2 計算肝臟指數 經左心室插管注入冰生理鹽水對肝臟灌流，瀝干水分稱肝重。計算肝臟指數=肝濕重/體質量×100%。

1．4．3 血清生化測定 下腔靜脈取血10 ml，室溫靜止，4000 r/min 離心20 min，迅速分離血清， -80 ℃冰箱保存。用全自動生化分析儀(日本Olympus AU400)檢測肝功能指標，如天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)含量；檢測血脂指標，如總膽固醇(TC)、總甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量；檢測血清中C-反應蛋白(CRP)含量，測定方法按試劑盒說明書進行。

1．4．4 實時定量PCR(探針法)檢測肝組織炎癥因子、脂肪因子基因表達 采用RNeasy Plus Micro Kit提取RNA并溶于20ulRNAase-free H2O中，測定RNA純度和濃度。反轉錄采用High Capacity RNA-to-cDNA 試劑盒,總體系為20ul，其中RNA溶液10μl，反應條件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min；4 ℃冷卻，RT-PCR采用Gene Expression Master Mix 試劑盒及GAPDH、MCP1、IFNγ、IL-4、IL-10探針和ABI 7500型基因擴增儀，總體系20 μl，其中10 μl Master Mix，8 μl ddH2O，1μl探針，1μl cDNA 模板，擴增條件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 預變性 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃退火延伸60 s，共60個循環。以內源性GAPDH作參照，使用ABI SDS 7500 software 軟件進行結果分析。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟指數及血清肝功能、CRP比較

表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟指數明顯升高(P<0.01)，而健脾化痰組(P<0.05)、易善復組(P<0.05)肝臟指數較模型組降低。

表1 大鼠肝臟指數、血清ALT、AST比較

注：與對照組比較:aaP<0.01；與模型組比較:bP<0.05，bbP<0.01

表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST含量略有增高，但差異無統計學意義；健脾化痰組、易善復組ALT、AST含量較模型組均有下降趨勢，健脾化痰組的ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)及易善復組的AST(P<0.05)下降較為明顯，差異有統計學意義。提示雖然模型組大鼠并無明顯肝功能改變，健脾化痰湯、易善復亦可對肝功能有不同程度改善作用。

表1顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中CRP含量明顯增高(P<0.01)，可達對照組的2.5倍；CRP作為急性時相反應蛋白，是一種非特異性的炎癥標志物，與急慢性炎癥性疾病密切相關。模型組CRP含量的增高提示機體處于炎癥狀態。健脾化痰組、易善復組CRP含量較模型組均下降明顯(P<0.05)，提示給藥組可不同程度地抑制炎癥狀態。

2.2 各組大鼠血脂含量的變化

表2顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL含量明顯增高(P<0.01)；TG含量略有增高，但差異無統計學意義(P>0.05)。HDL含量雖僅有下降趨勢，但HDL/TC明顯低于對照組(P<0.01)，提示模型組大鼠存在嚴重的脂質代謝紊亂。與模型組大鼠比較，健脾化痰組TG含量明顯降低(P<0.05)、HDL/TC明顯提高(P<0.05)，TC、LDL含量僅有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，這可能與灌胃脂肪乳中含有膽固醇有關，提示健脾化痰湯可明顯抑制由高脂飼料聯合脂肪乳灌胃引起大鼠血脂水平的增高。

表2 大鼠血清中TC、TG、LDL、HDL和HDL/TC含量比較

注：與對照組比較:aaP<0.01；與模型組比較:bP<0.05

2.3 大鼠肝組織炎癥因子的mRNA表達

表3顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中MCP1、IFNγ mRNA的表達明顯增高(P<0.05)，IL-10 mRNA有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；IL-4的表達與對照組比較無明顯差異。與模型組比較，健脾化痰組大鼠肝組織中IL-4、IL-10的mRNA表達增高，差異有統計學意義(P<0.05)；MCP1、IFNγ的mRNA表達有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，易善復組大鼠肝組織中IL-4、IL-10的mRNA表達增高更為明顯，差異有統計學意義(P<0.01)；MCP1、IFNγ mRNA的表達有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 大鼠肝組織中炎癥因子的mRNA表達(Ratio)

注：與對照組比較:aP<0.05；與模型組比較:bP<0.05，bbP<0.01

3 討論

脾虛生痰是脂肪肝形成的重要病機之一，脾主運化、統血、主升清，脾主運化體現在兩個方面，一是運化水谷精微，二是運化水濕。而飲食不節則會損傷脾胃，使脾的運化功能受損，不能正常消化飲食和轉輸水液，導致痰濕內生、蘊結于肝而發本病。臨床亦證實，應用健脾化痰法治療脂肪肝具有較好療效[7-9]。健脾化痰湯為《太平惠民和劑局方》中的二陳湯與四君子湯的和方，兼具健脾、化痰之功效。

目前公認的NAFLD的發病機制是1998年Day等[1]提出的“二次打擊”學說，即初次打擊由IR和高胰島素血癥導致的肝臟脂質沉積，二次打擊為氧化損傷、炎癥反應進一步引起的脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化等過程。參與二次打擊的炎癥反應在NAFLD發生發展過程中起重要作用。

C-反應蛋白主要由肝細胞和成熟的脂肪細胞合成及分泌，其表達受炎癥因子的調控，如TNF-α、IL-1β等與IL-6的關系最為密切。CRP是急性期反應蛋白的一種，是機體重要的防御分子，也是非特異性炎癥標志物之一，與急慢性炎癥性疾病密切相關，具有誘導單核、巨噬細胞黏附、聚集、活化和細胞因子、ROS產生的作用[3、10]。實驗結果顯示，模型組大鼠血清中CRP含量明顯高于對照組，提示機體可能處于炎癥狀態。健脾化痰組血清CRP含量較模型組明顯下降，提示健脾化痰湯可以抑制由高脂飲食引起的機體炎癥狀態，健脾化痰湯對脂肪肝的抑制作用亦可能與其抗炎作用有關。

由“二次打擊”學說可看出，細胞因子在NASH的發病機制中起很重要的作用。肝組織中的巨噬細胞(Kuppfer 細胞)是細胞因子產生的重要來源，巨噬細胞根據誘導因素、受體表達、分泌細胞因子及功能的不同分為兩類，即經典活化型(classically activated macrophages，M1型)和替代活化型(alternatively activated macrophages，M2型)。IFNγ是M1型巨噬細胞的誘導因子，MCP1是M1型巨噬細胞分泌的細胞因子，具有招募炎性巨噬細胞的作用[11]；IL-4是M2型巨噬細胞的誘導因子，IL-10是M2型巨噬細胞分泌的細胞因子。M1型巨噬細胞促進炎癥反應，M2型巨噬細胞具有抑炎作用[6、12]。實驗結果顯示，模型組大鼠肝組織中M1型誘導因子(IFNγ)和分泌因子(MCP1)的表達明顯增高，而模型組M2型誘導因子(IL-4)無明顯變化，M2型分泌因子(IL-10)有下降趨勢，說明模型組大鼠肝組織中巨噬細胞向M1型分化。健脾化痰組大鼠肝組織中M2型因子IL-4、IL-10表達明顯增高，而M1型因子MCP1、IFNγ的表達僅有下降趨勢，即健脾化痰組大鼠肝組織中有利于M2型巨噬細胞分化的Th2型細胞因子的產生增高。在炎癥反應過程中，M1型和M2型巨噬細胞極化的動態改變調節天然免疫參與的各種炎癥反應[13]，提示健脾化痰湯抑制高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝作用可能是通過促進巨噬細胞向M2型分化，從而抑制炎癥反應。

綜上所述，長期高脂飲食加脂肪乳灌胃可造成大鼠機體處于(慢性)炎癥狀態，健脾化痰湯對機體(慢性)炎癥狀態有一定的緩解作用，健脾化痰湯對肝臟的保護作用亦可能與促進巨噬細胞M2分化有關。

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