基于超高效液相色譜-質譜的漢源花椒麻味物質構成研究

徐珊珊，張璐璐，高海燕，汪厚銀，史波林，鐘葵，趙鐳*

(1.上海大學 生命科學學院，上海 200444；2.中國標準化研究院食品與農業(yè)標準化研究所， 北京 102200；3.浙江工商大學 食品與生物工程學院，杭州 310018)

1 概述

花椒是我國特色辛香料，主要產于四川、陜西、云南等省，其中四川漢源花椒以其色澤丹紅、油重粒大、酥麻爽口、芳香濃郁而聞名于世，素有“川味花椒之王”的美稱[1]。辛麻味是花椒主要風味物質和花椒重要品質的評價指標[2]。由于地域和氣候影響，不同產地花椒麻感特征差異較大，直接影響花椒在市場上的價格和銷售量。酰胺類物質是構成花椒辛麻味感的主要成分，花椒麻味感覺強度與其酰胺物質的總含量、構成和結構具有一定相關性。目前高精度分析花椒中酰胺類物質構成的研究較少，尤其是漢源花椒作為優(yōu)質產區(qū)花椒與其他產地花椒相比，其酰胺類物質及主要麻味物質特征尚不明確[3-5]。

超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(UPLC-MS/MS)具有檢測快、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)點[6]。本文在課題組前期研究基礎之上，選取9個漢源花椒樣品及麻味感覺強度(麻度)與漢源花椒相近或較高的我國5個花椒主產地樣品，利用UPLC-MS/MS對樣品中酰胺類物質及麻味物質進行定性定量分析，并結合聚類分析和主成分分析等將漢源花椒與其他產地花椒進行比較，得出漢源花椒的麻味物質構成特征。本研究對促進我國名優(yōu)特產四川漢源花椒質量評價、產業(yè)發(fā)展和豐富漢源花椒品質基礎數據庫等方面具有重要參考意義。

2 材料與方法

2.1 儀器與材料

14個花椒供試樣品：由四川川麻人家食品有限公司提供。樣品均于2016年8月份采摘，自然曬干。其中，S1～S9號花椒樣品均來自漢源花椒主產鄉(xiāng)鎮(zhèn)的不同村，每村5戶標準采樣，混勻后按四分法取樣。其余S10～S14號花椒樣品為其他主產區(qū)花椒種植基地定點采購，漢源花椒為南路(正路)花椒，其他產地花椒均為大紅袍，花椒品種被鑒定為ZanthoxylumbungeanumMaxim.。樣品產地信息見表1。

表1 花椒樣品產地及編號Table 1 Places of origin and number of Zanthoxylum bungeanum samples

羥基-β-山椒素標準品：由西南交通大學、中國標準化研究院研制，并經中國食品藥品檢定研究院檢驗符合中藥化學對照品的質量要求；無水乙醇：分析純，河南榮騰食品添加劑有限公司；甲醇：色譜純，F(xiàn)isher實驗器材(上海)有限公司；實驗室用超純水。

恒溫水浴鍋 品相科儀(上海)有限公司；PL2002型天平 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；Ultimate 3000超高效液相色譜儀、Hypersll Gold色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)、Q Exactive Focus液質聯(lián)用儀 賽默飛世爾(中國)有限公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 供試品溶液制備

將花椒除雜去柄、籽、包籽等，進行粉碎，過20目篩網。稱取15 g(精確到0.01 g)花椒粉，加無水乙醇75 mL，30 ℃條件下超聲提取20 min，超聲后，溶液全部倒入100 mL容量瓶中，無水乙醇定容至100 mL，搖勻后靜置10 min，取上清液0.05 mL用甲醇稀釋定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm有機系微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。每個樣品3個平行樣。

2.2.2 UPLC-MS色譜條件

色譜柱為Hypersll Gold(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動相為甲醇(B)-水(A)，洗脫梯度見表2，檢測波長為268 nm，柱溫為30 ℃，流速為0.25 mL/min，分析時間為20 min，進樣量為2 μL。每個樣品測定3次，取平均值。

離子源：加熱電噴霧電離源(HESI)，測定模式：Full MS和dd-MS2模式，正離子掃描；Full MS掃描范圍：50～600，噴霧電壓：3500 V；氣化溫度：320 ℃；鞘氣(氮氣)壓力：40 psi；輔助氣(氬氣)壓力：10 bar；毛細管溫度：320 ℃。

2.2.3 花椒酰胺類物質的定性分析[7-13]

采用UPLC-MS法對樣品中色譜峰進行定性分析。通過對樣品總離子流圖、提取離子流圖及分子量在50～600之間的離子二級碎片信息進行分析，確定其化合物分子量，計算化合物組成等，并結合文獻進一步推斷，對色譜峰進行定性。

2.2.4 花椒酰胺類物質的定量分析

根據參考文獻[14，15]中報道的半定量方法以羥基-β-山椒素標準品對花椒酰胺類物質進行半定量分析。

標準曲線的繪制：準確稱量一系列羥基-β-山椒素標準品，采用甲醇配制成一系列質量濃度的溶液。以高效液相色譜峰面積為縱坐標，對應標品濃度為橫坐標，得到標準曲線方程。為保證定量結果的可靠性，分別建立兩條低、高含量的羥基-β-山椒素標準曲線，低含量標準曲線為：y=61764x+185.66，相關系數R2=0.9988，適用濃度范圍為0.02～0.50 μg/mL；高含量標準曲線為：y=56668x+86333，相關系數R2=0.9999，適用濃度范圍為5～200 μg/mL。

2.2.5 聚類分析[16,17]

為探究花椒樣品中酰胺類物質種類的構成及含量之間的差異性，以樣品中色譜峰面積為變量作為分類依據。將表1中14個產地中花椒酰胺類物質的峰面積數據導入SPSS 22.0，利用組間連接法，對14個產地花椒進行系統(tǒng)聚類分析。

2.2.6 主成分分析(PCA)[18,19]

PCA是將所提取的多指標信息通過數據轉換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類，在坐標軸上通過投影將所有信息可視化的一種方法，最終將得到二維的PCA散點圖，通過散點圖可以直觀地看出被分析數據之間的相互關系。PC1和PC2是散點圖中的2個坐標軸，包含了在PCA轉換中得到的第1主成分和第2主成分的貢獻率，貢獻率越大，說明主要成分越具有代表性。一般總貢獻率超過70%～85%，此方法即可使用。通過PCA分析方法確定漢源花椒中特征麻味物質。

2.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行系統(tǒng)聚類分析，采用Alphasoft 11.0進行主成分分析(PCA)。

3 結果與分析

3.1 花椒中酰胺類及麻味物質的定性分析

表3 花椒樣品中酰胺類物定性和定量分析Table 3 Qualitative and quantitative analysis of amides in Zanthoxylum bungeanum samples

注：“-”代表未檢出。

采用UPLC法得到14個花椒樣品的疊加色譜圖，見圖1，各樣品色譜峰分離度良好。

圖1 14個花椒樣品的UPLC疊加色譜圖Fig.1 The UPLC chromatograms of 14 Zanthoxylum bungeanum samples

利用高分辨質譜對花椒中各色譜峰進行定性分析，通過對樣品總離子流圖、提取離子流圖及分子量在50～600之間的離子二級碎片信息進行分析，樣品中各色譜峰由ESI(+)質譜圖給出的[M+H]+離子及m/z，可確定離子為加氫離子，即得到化合物分子質量，通過高分辨質譜二級譜圖信息，計算得出化合物組成、同位素分布等，結合文獻[20，21]進一步推斷各酰胺類物質可能的結構信息。由表3可知，14個樣品中共得到25種具有酰胺結構的物質，結合文獻數據分析得出其中包括12種麻味物質，分別為花椒油素、羥基-ε-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、α-山椒素、β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-γ-花椒素、花椒素、異花椒素、γ-山椒素、四氫花椒素。25種酰胺類物質中，有10種化合物尚未鑒定。漢源9個不同產區(qū)的花椒樣品中共有19種酰胺類物質，其中共有峰有18個；差異峰有1個，為二氫花椒素，僅在4個漢源花椒樣品中出現(xiàn)。結果表明不同產區(qū)漢源花椒的酰胺類主要物質組成基本相同。其中，9個漢源花椒樣品均含有除花椒油素、α-山椒素、β-山椒素之外的其他9種麻味物質，與趙志峰等在研究漢源干花椒油中麻味物質結果一致。其他產地花椒中，酰胺物質種類最多的是陜西韓城花椒，有15種酰胺類物質。此外，山東花椒樣品有花椒油素，而其他花椒樣品中均未檢出。

通過與其他5個產地花椒比較發(fā)現(xiàn)，有4個色譜峰只在漢源花椒中出現(xiàn)，其中2個色譜峰為去氫-γ-山椒素和類二氫花椒素，其余化合物名稱及有無麻味等信息目前未見報道，有待進一步結合酰胺類物質分離純化、感官評價及NMR技術研究進行確定。

3.2 花椒中酰胺類及麻味物質的定量分析

通過低含量和高含量所對應的2條標準曲線對14個花椒樣品的酰胺類及麻味物質進行定量分析，結果見表3。由表3可知，漢源花椒9個樣品中酰胺類物質總含量在7431.97～10007.65 mg/100 g之間，平均含量為8723.75 mg/100 g，相對標準偏差(CV值)為15.3%；麻味物質含量在7216.05～9722.74 mg/100 g之間，平均含量為8473.37 mg/100 g，其CV值為10.5%，表明不同產地的漢源花椒樣品中酰胺類物質含量差異較小，具有較高相似度。全國其他5個產地花椒的酰胺類物質總含量在922.33～4280.02 mg/100 g之間，麻味物質含量在901.60～4189.97 mg/g之間。漢源花椒中平均酰胺類物質及麻味物質含量均高于其他5個產地花椒樣品，表明漢源花椒作為優(yōu)質產區(qū)花椒有其獨特質量優(yōu)勢。

表3結果表明：麻味物質是花椒酰胺類物質的主要構成物質，占酰胺類物質總含量的97%左右。盡管漢源花椒與其他產地花椒在酰胺類物質和麻味物質的含量、組成上有差異，但14個樣品中麻味物質含量占比沒有顯著差異。因此，對花椒樣品中麻味物質組成差異進一步展開分析，結果見表4。

表4 花椒樣品麻味特征物質組成分析Table 4 Composition analysis of pungent components in Zanthoxylum bungeanum samples %

注：“-”代表未檢出。

漢源花椒的9種麻味物質組成中，5種為山椒素，4種為花椒素，其比例分別為97%和3%，呈現(xiàn)高山椒素、低花椒素的麻味物質構成特點。山椒素組成中以羥基-山椒素為主，特別是羥基-α-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-β-山椒素，其平均含量分別約占整體麻味物質含量的74%，18%和3.5%，4種羥基-山椒素含量約占麻味物質含量的96%。9個漢源花椒樣品中各麻味物質組成及含量差異不顯著，表明不同地區(qū)的漢源花椒樣品呈現(xiàn)出相似的麻味物質構成。

其他5個產地花椒樣品中，麻味物質構成特征也整體呈現(xiàn)高山椒素、低花椒素的特點。山東花椒樣品特異性表現(xiàn)明顯，其花椒油素含量較高，占比為21.2%，而其他花椒中未發(fā)現(xiàn)此類物質。青?；ń窐悠分袃H含有羥基-山椒素，且羥基-α-山椒素占比(88.8%)顯著高于其他產地樣品。其余3個產地花椒樣品中，羥基-山椒素占比約為98%，顯著高于漢源花椒；而山椒素和花椒素含量均顯著低于漢源花椒。

3.3 聚類分析

圖2 14個產地花椒聚類分析圖Fig.2 Clustering analysis of 14 Zanthoxylum bungeanum samples

系統(tǒng)聚類可以根據樣品之間的親疏遠近關系將四川漢源花椒與全國其他產地14個花椒樣品進行聚類。由圖2可知，14個花椒樣品共聚為三類，其中漢源花椒樣品19個色譜峰中有18個共有峰，化學成分基本相同，麻味物質含量在7216.05～9722.74 mg/100 g之間，含量較高，聚為一類(1～9號樣品)；河北、陜西、山西和山東花椒麻味物質含量在2586.98～4189.97 mg/100 g之間，屬于中等含量，聚為一類(10，12～14號樣品)。青?；ń窐悠分絮０奉愇镔|種類最少，只有6種，麻味物質含量為901.60 mg/100 g，含量較低，其花椒質量明顯區(qū)別于其他產地，因此單獨聚為一類(11號樣品)。

3.4 主成分分析(PCA)

主成分分析法(PCA)是一種常用的多元統(tǒng)計方法，利用降維思想，把具有一定相關性的多個影響因素轉化為少數綜合指標進行分析，找出樣品間相關聯(lián)的特征。選取14個樣品中的12種麻味物質進行PCA分析，見圖3。

圖3 基于麻味物質含量的花椒樣品主成分分析Fig.3 Principal component analysis of Zanthoxylum bungeanumsamples based on the content of pungent components

注：S為樣品編號，F(xiàn)1為花椒油素，F(xiàn)3為羥基-ε-山椒素，F(xiàn)4為羥基-α-山椒素，F(xiàn)5為羥基-β-山椒素，F(xiàn)10為羥基-γ-山椒素，F(xiàn)12為α-山椒素，F(xiàn)13為羥基-γ-花椒素，F(xiàn)14為β-山椒素，F(xiàn)16為花椒素，F(xiàn)17為異花椒素，F(xiàn)21為γ-山椒素，F(xiàn)25為四氫花椒素。

第1主成分PC1的貢獻率為98.46%，第2主成分PC2的貢獻率為0.83%，總貢獻率為99.29%，說明主成分具有代表性。通過PCA分析把14個花椒樣品分為三類，即S1～S9號樣品為一類，S11樣品為一類，其余樣品為一類，同聚類結果一致。圖3中S表示樣品編號，F(xiàn)表示色譜峰編號，色譜峰距離樣品越近說明其相關性越高，以S8樣品為漢源產地花椒聚類中心，分析色譜峰與漢源產地樣品之間的關聯(lián)性。以向量空間距離來看，色譜峰10為羥基-γ-山椒素，距離漢源樣品最近，相關性較高。

4 討論

羥基-山椒素(α，β，γ，ε)是花椒中的主要麻味成分，進行分析發(fā)現(xiàn)，本研究中的河北、陜西、山西、山東和青?；ń分械牧u基-山椒素的構成特征為羥基-α-山椒素>羥基-β-山椒素>羥基-ε-山椒素>羥基-γ-山椒素，而漢源花椒中的羥基-山椒素的構成特征為羥基-α-山椒素>羥基-γ-山椒素>羥基-β-山椒素>羥基-ε-山椒素。與其他產地花椒體現(xiàn)不同的是，漢源花椒中羥基-γ-山椒素含量均大于其他5個產地的，是僅次于羥基-α-山椒素的第二大麻味物質，可以看出羥基-γ-山椒素是漢源花椒區(qū)別于其他5個產地花椒的主要麻味物質，與主成分分析結果相一致。Chen Huai-xuan等研究了漢源花椒與西南地區(qū)其他產地花椒的差異。漢源花椒中羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的比例為1∶1.5，青川、茂縣、汶川和重慶產地花椒中的比例依次為19.2∶1，4.5∶1，6.9∶1和5.3∶1；漢源花椒中羥基-γ-山椒素的含量顯著高于其他產地花椒，是區(qū)別于其他產地花椒的主要麻味物質，與本研究結果一致。通過與本研究中5個產地花椒及其他文獻比較總結可得出，花椒的麻味物質構成特征整體表現(xiàn)為高羥基-山椒素、低花椒素特點，但不同產地和品種花椒的麻味物質構成模式不同，四川漢源高羥基-γ-山椒素含量是漢源花椒區(qū)別于其他產地花椒的最主要麻味特征。同時，漢源花椒中山椒素和花椒素含量也略高于全國其他產地花椒。

5 結論

本文利用超高效液相色譜結合高分辨率質譜(UPLC-MS)，主要探究我國四川漢源花椒中麻味物質構成種類及含量分析。通過高分辨質譜分析，確定14個樣品中共有12種麻味物質，漢源花椒中有9種，分別為羥基-α-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-花椒素、γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、花椒素、異花椒素、四氫花椒素。通過定量分析發(fā)現(xiàn)，漢源花椒中羥基-α-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-ε-山椒素的平均含量占總酰胺平均含量的比例達到92.23%，得出漢源花椒麻味物質構成特征表現(xiàn)為高羥基-山椒素、低花椒素特點。與其他5個產地比較發(fā)現(xiàn)，漢源花椒中羥基-山椒素的構成特征為羥基-α-山椒素>羥基-γ-山椒素>羥基-β-山椒素>羥基-ε-山椒素，其中羥基-γ-山椒素含量約為14%，均大于其他5個產地，是僅次于羥基-α-山椒素的第二大麻味物質，可看出高羥基-γ-山椒素含量是漢源花椒區(qū)別于其他產地花椒的麻味特征。結合聚類分析及主成分分析發(fā)現(xiàn)，漢源花椒可以和全國其他產區(qū)樣品進行明確區(qū)分。

花椒品質主要體現(xiàn)在麻味感覺強度及麻香兩個方面，本文中利用UPLC-MS對漢源地區(qū)花椒進行定性定量分析，對完善我國名優(yōu)特產漢源花椒的質量評價，打造特色產品品牌，促進漢源地方經濟發(fā)展等方面具有重要參考意義，在后續(xù)研究中將結合感官評價、GCMS-O等手段進一步探究不同漢源產區(qū)的花椒麻度及麻香分類情況，從麻味物質構成、麻味感覺強度及麻香等多維度解析漢源花椒的品質特征，以進一步豐富漢源花椒品質基礎數據庫。

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