不同產地小茴香香氣成分差異分析

魏泉增，胡旭陽

(1.許昌學院 食品與生物工程學院,河南 許昌 461000；2.河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室,河南 許昌 461000)

小茴香，既是調味料，又是具有較高價值的中藥[1]。小茴香主要香氣成分具有抗癌和抗菌活性[2,3]，因此小茴香的香氣成分報道較多。香氣成分常見提取方法有3種：水蒸氣蒸餾(WD)法，具有設備比較簡單、操作容易等優點，得到的主要香氣成分為檸檬烯、反式茴香腦、α-水芹烯及愛草腦等[4-6]。同時蒸餾萃取(SD)法，具有微量成分提取效率高，適用于熱穩定、沸點高的物質，得到主要香氣成分為反式-茴香腦、愛草腦、葑酮及茴香醛[7]。固相微萃取(SPME)法，具有無萃取溶劑、操作時間相對較短、使用的樣品量小的優點，得到主要香氣成分是反式-茴香腦、順式-茴香腦、愛草腦、葑酮和p-茴香醛等[8]。目前，一個產地小茴香氣成分報道較多，不同產地小茴香香氣成分差異鮮有報道，本文采用不同提取方法結合GC-MS，比較了不同產地小茴香香氣成分的差異。采用主成分分析和聚類分析SPME法得到不同產地香氣組成的相似度，這為不同品種的小茴香資源的綜合利用開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原料：5種小茴香的原料均購買于當地超市，分別為四川某某小茴香(以下簡稱為四川小茴香)、甘肅某某小茴香(以下簡稱為甘肅小茴香)、青海某某小茴香(以下簡稱青海小茴香)、山東某某小茴香(簡稱為山東小茴香)，北京某某小茴香(以下簡稱為北京小茴香)。以甘肅、北京、四川、青海、山東的小茴香為原料(打碎30 s，過篩40目)。

1.2 試劑與儀器

試劑：二氯甲烷(色譜純)、蒸餾水。

儀器：7890B-7000C型氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；萃取手柄和萃取頭65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯) 青島貞正分析儀器有限公司；恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器有限公司；粉碎機 上海圣科儀器設備有限公司；電子天平、電爐 上海菁海儀器有限公司；水蒸氣蒸餾裝置 鄭州興華玻璃儀器公司；同時蒸餾萃取裝置 賽克斯玻璃儀器有限公司。

1.3 香氣萃取

1.3.1 水蒸氣蒸餾

粉碎的小茴香準確稱取10.00 g，置于200 mL平底燒瓶中，加入100 mL蒸餾水，沸騰2 h。抽取2 mL揮發油備用，不同產地分別重復3次。

1.3.2 同時蒸餾萃取

粉碎的小茴香準確稱取10.00 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL去離子水。將40 mL二氯甲烷倒入100 mL圓底燒瓶中。500 mL圓底燒瓶用電爐加熱，100 mL圓底燒瓶用恒溫水浴加熱，溫度控制在60 ℃。兩側同時回流時開始計時，提取2 h，抽取2 mL二氯甲烷備用，不同產地分別重復3次。

1.3.3 頂空固相微萃取

粉碎的小茴香稱取1.00 g置于15 mL頂空瓶中，加入5 mL去離子水，60 ℃平衡30 min，60 ℃頂空吸附30 min，氣相氣化室250 ℃解吸附3 min，不同產地分別重復3次。

1.4 GC-MS分析條件

水蒸氣蒸餾方法的氣相色譜條件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比100∶1，進樣量1.0 μL，進樣口溫度250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：50 ℃先以4 ℃/min升至110 ℃，然后以5 ℃/min升至160 ℃，再以3 ℃/min升至190 ℃，保持20 min。每個產地的小茴香平行3次，每種化合物峰面積取3次的平均值。

同時蒸餾萃取方法的氣相色譜條件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比2∶1，進樣量1.0 μL，進樣口溫度250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：50 ℃先以3 ℃/min升至110 ℃，然后以5 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃,保持10 min。每個產地的小茴香平行3次，每種化合物峰面積取3次的平均值。

固相微萃取方法的氣相色譜條件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比100∶1，進樣量1.0 μL，進樣口溫度250 ℃；壓力：19.93 kPa；升溫程序：50 ℃先以4 ℃/min升至90 ℃，然后以5 ℃/min升至140 ℃，再以4 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。每個產地的小茴香平行3次，每種化合物峰面積取3次的平均值。

質譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描模式MS1，掃描范圍29～700 amu。

1.5 香氣物質的定性與半定量

香氣物質采用NIST 14 質譜數據庫檢索進行定性，取相似度大于70%的化合物；用峰面積表示化合物含量。

1.6 數據分析

試驗數據采用PAST軟件，采用模型correlation對不同產地小茴香進行主成分分析，采用配對分組算法(paired group)，相似度采用Rho法進行不同產地小茴香聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取小茴香香氣成分

2.1.1 SD提取小茴香香氣成分的分析

SD提取小茴香的揮發性香氣成分GC-MS分析，結果見圖1。共鑒定出38種香氣成分，包括18種烴類物質、5種醇類、5種醚類、3種醛類和7種酮類物質。

圖1 采用SD法不同產地小茴香香氣成分Fig.1 Aroma compounds of fennel from different places of origin with SD method

由圖1可知，采用SD法，香氣成分中醚類物質的含量最多,但北京、甘肅、青島、山東4個產地的小茴香香氣中醚類物質含量相似，四川小茴香香氣中，醚類含量偏低。5個產地小茴香香氣中，烴類物質含量次多，四川小茴香中烴類物質偏低，其他產地烴類物質含量相似。5個產地小茴香醛類中，山東含量最高，四川含量最低，其他3個產地含量相似。5個產地中四川酮含量偏低，其他4個產地酮含量相似。而5個產地小茴香、醇類、酚類、酯類含量較少。

2.1.2 SPME提取小茴香香氣成分的分析

采用SPME提取小茴香的揮發性香氣物質，結果見表1。不同產地的小茴香中共鑒定出19種香氣成分，其中包括3種烴類物質、7種萜烯，1種醇類、1種酯類、2種醚類、2種醛類、2種酮類和1種酸類物質。采用SPME法，見圖2。5個產地小茴香香氣成分中醚類物質含量最多，不同產地醚類含量相似。烴類物質四川含量偏低，其他4個產地含量相似。醛類物質含量，甘肅含量最低，山東含量最高，其他3個產地含量相似。5個產地小茴香酮類含量相似。5種產地小茴香、酯類、酸類、醇類含量較少。

圖2 采用SPME法不同產地小茴香香氣成分Fig.2 Aroma compounds of fennel from different places of origin with SPME method

編號名稱中文名稱北京甘肅青海山東四川1Xanthoxylin花椒素酯類NDND14725260±2653215.41NDND2D-Carvone香芹酮酮類2029152.33±169642.753093422±1036892.852023643.67±107181.331892555.67±162335.2510772785±130782.733Fenchone葑酮酮類13173987±1009928.6714691848±2226025.8621731403.67±972525.420928459±4084967.3913555742.67±1756585.84α-Phellandreneα-水芹烯萜烯NDND1720673.67±181396.53NDND5γ-Terpineneγ-松油烯萜烯16643573±1058333.4516380118±6457782.3319586802±4220661.8428389758±993455.7611464940±837551.886Benzene,1-methyl-3-(1-methylethyl)-1-甲基-(2-甲基乙基)-苯烴類12623540.33±547940.17526635.67±2052908.8513289688.67±2739676.2520397755±1567311.2820111593.33±1610113.867Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-雙環[3.1.0]己烷,4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-烴類ND3282601±119064.64ND4353095.33±216311.34ND

續 表

注：ND表示未檢出。

2.1.3 WD提取小茴香香氣成分分析

采用WD法提取小茴香的揮發性香氣物質，數據未給出。結果表明：5種產地小茴香香氣成分中共鑒定出107種香氣成分，其中包括35種烴類物質、23種醇類、14種醚類、1種酸類、1種酚類、10種酯類、10種酮類和13種其他物質。采用WD法，見圖3。5個產地小茴香香氣成分中醚類物質含量最多，四川小茴香醚類含量最多，北京小茴香醚類含量最少，其他3個產地小茴香醚類含量差異較大。烴類物質甘肅含量最多，北京含量最少，其他3個產地小茴香烴類含量差異較大。酮類、醛類、酸類、酯類、醇類和酚類含量較少。

圖3 采用WD法不同產地小茴香香氣成分Fig.3 Aroma compounds of fennel from different places of origin with WD method

SD法、SPME法、WD法3種提取方法分析不同產地的小茴香香氣成分，結果表明醚類物質種類少，但醚類的含量大。醇類、酯類、酮類和醛類含量少，烴類物質種類最多，烴類物質的含量也少，酸類和酚類含量最少。SD法、SPME法和WD法提取不同產地小茴香香氣種類含量大體相似，醚類含量最多，但不同提取方法對提取不同產地小茴香不同香氣種類含量有較明顯差異。

2.2 不同產地小茴香香氣成分比較

2.2.1 醇類香氣物質比較

5種小茴香中共檢測到26 種醇類物質，北京、甘肅、青海、山東、四川分別檢出2，11，3，20，15種，SD法檢測到5種醇類,SPME法檢測到1種醇類,WD法檢測到24種醇類。結果表明：采用WD法,醇類在5 種小茴香種差異明顯。桉葉油醇是小茴香中含量最高的醇。松油醇具有油味、樟腦氣味和甜味。甘肅、青海、四川產地的小茴香WD法檢測到松油醇，其他產地未檢測到。

2.2.2 酯類香氣物質比較

5個產地小茴香中共檢測到10種酯類物質，其中，WD法檢測出10種酯類物質，SPME法檢出1種，SD法未檢出酯類。WD法檢出5個產地小茴香酯類物質種類差異明顯，四川檢出8種，9,12-十八碳二烯酸甲酯是含量最高的酯類。甘肅小茴香檢出丁酸-3-甲基-異戊酯和乙酸松油酯。采用SPME法在青海小茴香只檢出1種酯類，花椒素。

2.2.3 醛類香氣物質比較

5個產地小茴香共檢測出4種醛類物質,其中,SD法檢測出2種,SPME法檢測出2種,WD法檢測出4種。結果表明：具有類似山楂味的3-甲氧基苯甲醛采用這3種方法在5個產地的小茴香中都檢測到。采用WD法，3-甲氧基苯甲醛在山東小茴香中含量>在四川小茴香中含量>在甘肅和青海小茴香中含量>在北京小茴香中含量。采用SD法，3-甲氧基苯甲醛在山東小茴香中含量>在北京小茴香中含量>在青海和四川小茴香中含量>在甘肅小茴香中含量。采用SPME法，3-甲氧基苯甲醛在山東小茴香中含量>在四川小茴香中含量>在青海和北京小茴香中含量>在甘肅小茴香中含量。由此，采用不同提取不同產地的小茴香同一香氣成分含量的變化并不相同，這表明不同香氣提取方法對不同產地小茴香香氣成分的收率也不同。2-乙縮醛-6-甲基-3,5-庚二烯醛和2-甲基-3-苯基-丙醛只在四川小茴香中檢測到。

2.2.4 酮類香氣物質比較

5種小茴香中共檢出13種酮類物質，其中SD法檢出6種,SPME法檢出2種,WD法檢出10種。葑酮(fenchone)是抗菌素的一種，能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素。呈濃郁甜的果香、青香和木香，具有鮮花和水果甜香氣。采用WD法提取葑酮，山東小茴香中含量>甘肅小茴香中含量>四川和青海小茴香中含量>北京小茴香中含量。香芹酮有清涼而特有的芳香甜味，WD法提取香芹酮，四川小茴香中含量>甘肅、山東、青海小茴香中含量，北京小茴香中沒有檢測到，但采用SPME法和SD法在北京小茴香中檢測到了香芹酮。采用SD法檢出了1-(3-甲氧基苯基)-1-丙酮、薄荷酮、莰酮，其他2種方法未檢出。

2.2.5 萜烯類香氣物質比較

5種小茴香中共檢出25種萜烯類香氣物質，其中SD法檢出12種物質，SPME法檢出8種物質，WD法檢出23種物質。檸檬烯是一種天然的功能單萜，有類似檸檬的香味。檸檬烯具有良好的鎮咳、祛痰、抑菌作用。采用WD法，甘肅小茴香中檸檬烯含量>山東小茴香中含量>四川小茴香中含量>北京小茴香中的含量>甘肅小茴香中含量。采用這3種方法均檢測到了α-水芹烯、β-月桂烯、β-水芹烯、γ-松油烯、3-蒈烯、檸檬烯這6種萜烯。氧化檸檬烯只有WD法檢測到，其他2種方法未檢測到。SPME法檢測到了α-蒎烯。α-蒎烯具有植物和松節油香氣[9]，感官閾值很低，香氣明顯。

2.2.6 醚類香氣物質比較

5種小茴香中檢出11種醚類。其中SD法檢測出5種，SPME法檢出2種，WD法檢出10種。茴香腦是小茴香中主要的香氣成分，可用于治療癌癥及長期接觸放射線或藥物所致或原因不明的低白細胞癥[10]。草蒿腦呈大茴香似香氣。采用SD法，山東小茴香中茴香腦含量>青海小茴香中含量>北京小茴香中含量>甘肅和四川小茴香中含量，采用SPME法，山東、北京、青海、四川小茴香中茴香腦含量相似，甘肅小茴香中茴香腦含量明顯偏低。采用WD法，山東小茴香中茴香腦含量>四川小茴香中含量>甘肅小茴香中含量>青海小茴香中含量>北京小茴香中含量。采用SD法、SPME法和WD法提取不同產地的小茴香中香氣成分，其中草蒿腦在不同產地小茴香中香氣也出現了與茴香腦相似的情況，不同的前處理方法，導致草蒿腦在不同產地小茴香香氣中含量發生了變化。采用WD法，檢測到了對-丙烯基-1-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯、細辛腦、肉豆蔻醚、丁香酚甲醚、4-乙酰-1-甲基環己烷、(R)-氧化檸檬烯，而采用SD法和WD法在這5種小茴香中沒有檢測到。

2.2.7 烴類物質

除以上相對含量較高的香氣物質外，還有少量的烷烴類物質，共檢出15種物質。其中SD法檢出7種物質，SPME法檢出3種物質，WD法檢出12種烷烴，這類物質大部分不參與呈香。

2.3 主成分分析

主成分分析(PCA)是一種降維或者把多個指標轉化為少數幾個綜合指標的一種多元數理統計方法[11-13]。將5個產地小茴香樣品的二維數據導入到PAST軟件將數據標準化后進行主成分分析，5個不同產地小茴香采用SPME提取方法重復3次實驗。不同產地小茴香香氣成分PCA的分值圖見圖4，第一主成分的貢獻率為41.9%，第二主成分的貢獻率為23.7%。

圖4 PCA分值圖Fig.4 Score plot for PCA

由圖4可知，青海、山東、甘肅、北京、四川5個產地具有明顯差異，這為區分不同產地的小茴香提供了潛在的線索。

圖5 載荷圖(圖中的數字對應表1中)Fig.5 Loading plot(the figure in the plot corresponds to that of table 1)

由圖5可知，被分析化合物對主成分的影響，如果化合物遠離原點表明這個化合物對主成分有強烈的影響，那么這些化合物可能就是區分不同產地小茴香的關鍵化合物，以γ-松油烯(5號，表1中)和檸檬烯(11號，表1中)為潛在特征物，為區分不同產地小茴香提供可能。

2.4 聚類分析

聚類分析是將樣品按照品質特性的相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優先聚合在一起，最終按照類別的綜合性質多個品種聚合，從而完成聚類分析的過程[14]。對不同產地小茴香進行兩兩比對，相似性系數為0.8～1。結果表明：不同產地小茴香香氣成分明顯不同。

圖6 不同產地小茴香的聚類分析圖Fig.6 Clustering analysis diagram for the fennel from different places of origin

由圖6可知，四川小茴香與其他四個產地小茴香香氣成分的相似性最差，山東和北京的小茴香香氣成分最相似，由聚類分析結果表明，產地相近的小茴香香氣成分相似性大，而產地遠的小茴香香氣成分相似性小。

3 結論

WD法、SD法、SPME法3種提取方法對5個不同產地的小茴香香氣成分提取，而后進行GC-MS分析，共鑒定出104種化學組分，包括15種烴類、24種醇類、10種酯類、4種醛類、1種酚類、2種酸類、11種醚類、13種酮類、萜烯24種。其中鑒定WD法93種、SD法39種、SPME法19種。3種提取方法都表明5個產地小茴香主要成分是茴香腦和草蒿腦。WD法測得的香氣物質種類最多，SPME法測得的香氣物質種類最少。不同的提取方法提取不同產地小茴香香氣成分含量影響較大。SPME-GC-MS結合PCA分析結果表明：γ-松油烯和檸檬烯可為潛在特征物標記物，區分不同產地小茴香。聚類分析結果表明：產地相近的小茴香香氣成分也相似。

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