四種蔥屬植物醇提物抗氧化活性比較

劉陽(yáng)，王碩，李莎莉，吳琦，許悅，王麗虹

(武昌理工學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，武漢 430223)

蔥屬植物(Allium)為百合科(Liliaccae)蔥族(Allieae)，約400 多個(gè)品種，我國(guó)境內(nèi)約有100 多種，其中作藥用的約20 余種。《本草綱目》也有關(guān)于“正月蔥，二月韭”的記載，指農(nóng)歷正月的香蔥和二月后生長(zhǎng)的韭菜最有益于人體健康，具有醫(yī)治胸悶、傷寒、風(fēng)濕、解渴等功效[1]。蔥屬植物含有維生素C、蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分以及豐富的黃酮類化合物、含硫化合物、多糖等生物活性物質(zhì)，具有抗血小板凝集、抑菌、抗氧化等多種生理功能[2，3]。李璐等研究表明：不同種蔥屬植物抗氧化活性差異較大，而同種植物不同溶劑提取物中主要活性物質(zhì)的含量差別也較大，其中醇提物中含有較高的黃酮類化合物，而具有較強(qiáng)的抗氧化活性[4]。研究結(jié)果顯示：細(xì)香蔥醇提物中黃酮類化合物和含硫化合物含量顯著高于其他溶劑提取物，而成為抗胃癌活性部位。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究和臨床試驗(yàn)證明：人體內(nèi)的自由基動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)各種氧化損傷，形成大量畸變的蛋白分子，誘發(fā)腫瘤等多種疾病[5]。隨著對(duì)自由基研究的逐步深入，研究者們已認(rèn)識(shí)到體內(nèi)多余自由基的清除有利于某些疾病的預(yù)防和治療，因此開(kāi)發(fā)和利用無(wú)毒、高效的天然抗氧化劑對(duì)人體健康意義重大，是食品科學(xué)、生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[6]。大蒜(AlliumsativumL.)、韭菜(AlliumtuberosumRottl.)、洋蔥(AlliumcepaL.)大蔥(AlliumfistulosumL.)是我國(guó)常見(jiàn)、歷史悠久的藥食兩用鱗莖植物，本研究采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(·OH)清除率和總還原能力多種方法對(duì)4種蔥屬植物醇提物的體外抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較，以期為篩選活性較強(qiáng)的天然抗氧劑和蔥屬植物藥食資源的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

新鮮洋蔥、大蒜、韭菜、大蔥：購(gòu)于武商量販江夏店(產(chǎn)地：湖北)；DPPH(批號(hào)：M07334)：成都西亞化工股份有限公司；鄰苯三酚等：均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水：為純化水。

1.2 儀器

UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；雷磁 pHs-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；SB-3200DT超聲儀 寧波新芝生物有限公司；UPT-II-10T優(yōu)普超純水器 成都超純科技有限公司；CPA225D電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蔥屬植物醇提液的制備

分別取洗凈晾干的新鮮洋蔥、大蔥、韭菜及大蒜(去皮)20 g，加入160 mL 70%乙醇攪拌成粘稠狀態(tài)，35 ℃超聲40 min，抽濾，保留濾液，濾渣中加入80 mL 70%乙醇混合均勻同法處理，合并2次濾液。取適量濾液測(cè)定含量，以蘆丁計(jì)，其醇提液中黃酮含量分別為大蒜0.184 mg/mL，洋蔥0.179 mg/mL，大蔥0.128 mg/mL，韭菜0.124 mg/mL。

2.2 DPPH·清除率的測(cè)定

DPPH·于517 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，加入抗氧劑(樣品)后，孤對(duì)電子被配對(duì)[7]，吸收強(qiáng)度減弱。因此，可通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)評(píng)價(jià)樣品的DPPH·清除能力。

參考郭奎彩等[8]的方法，并加以改進(jìn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將蔥屬植物醇提液用70%乙醇稀釋5倍作為樣品溶液。從中分別取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，加70%乙醇補(bǔ)充至2.00 mL后，均加入0.2 mmol/L DPPH·溶液(95%乙醇配制) 2.0 mL，搖勻后室溫避光反應(yīng)40 min，再于517 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(1)計(jì)算清除率。

(1)

式中：A0為DPPH·溶液的吸光度，A1為樣品與DPPH·反應(yīng)后的吸光度，A2為樣品溶劑的吸光度。

2.3 O2-·清除率的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[9]可知，通過(guò)測(cè)定鄰苯三酚反應(yīng)體系吸光度的大小可評(píng)價(jià)樣品對(duì)O2-·的清除能力。

將蔥屬植物醇提液用70%乙醇稀釋10倍作為樣品溶液，從中分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加70%乙醇至1.0 mL，加入6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)搖勻，于37 ℃水浴中孵育10 min，再加入1.0 mL 7 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液(37 ℃預(yù)熱)，混勻后在相同溫度下反應(yīng)4 min，然后加入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在325 nm處測(cè)定樣品吸光度A1；以等體積的上述緩沖溶液代替樣品，同法操作，測(cè)得空白吸光度A0[10]，根據(jù)公式(2)計(jì)算樣品對(duì)O2-·的清除率。

(2)

式中：A0為空白的吸光度，A1為樣品的吸光度。

2.4 ·OH 清除率的測(cè)定

·OH 清除率是反映藥物抗氧化活性的重要指標(biāo)，可采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測(cè)定[11]，其原理是：H2O2在鄰二氮菲-Fe2+催化下分解成·OH，自身被·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+使510 nm處的最大吸收消失。向體系中加入的抗氧劑(樣品)能與·OH反應(yīng)而減少鄰二氮菲-Fe2+的損失[12]，通過(guò)測(cè)定體系510 nm處的吸光度可評(píng)價(jià)樣品的·OH 清除能力。

將蔥屬植物醇提液用70%乙醇稀釋5倍作為樣品溶液，分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加70%乙醇至1.0 mL后，各加入1.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲、4.0 mL 0.5 mol/L PBS(pH 7.4)、1.0 mL 7 mmol/L FeSO4和0.1% H2O2溶液1.0 mL，均補(bǔ)加純水至10.0 mL，于37 ℃水浴反應(yīng)90 min后在510 nm處測(cè)定吸光度，按照公式(3)計(jì)算·OH的清除率。

(3)

式中：A2為樣品溶液的吸光度，A0為以純水代替樣品的吸光度，A1為樣品和H2O2均以純水代替的吸光度。

2.5 總還原能力的測(cè)定

由于鐵氰化鉀中的Fe3+會(huì)被蔥屬植物中的某些成分還原，生成的普魯士藍(lán)在700 nm處有最大吸收, 其吸光度值與還原能力呈正相關(guān)。所以可以用此方法比較吸光度值的大小，間接測(cè)定4種蔥屬植物的抗氧化活性大小。

取蔥屬植物醇提液用70%乙醇稀釋5倍為樣品溶液，分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加70%乙醇至1.0 mL，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀和2.5 mL 0.2 mol/L PBS(pH 6.6)，混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)30 min，急速冷卻并加入2.5 mL 10%三氯乙酸水溶液，搖勻，于4000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，加入蒸餾水和0.1% FeCl3溶液各2.5 mL，搖勻并靜置10 min后測(cè)700 nm處的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 4種蔥屬植物對(duì)DPPH·的清除能力

根據(jù)2.2進(jìn)行操作，4種蔥屬植物對(duì)DPPH·的清除率結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4種蔥屬植物醇提物的DPPH·清除率Fig.1 The DPPH radical scavenging rates of ethanol extracts among four Allium species

由圖1可知，4種蔥屬植物對(duì)DPPH·均具有一定的清除能力，但隨濃度升高其清除率增加不明顯；在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，大蒜、洋蔥、大蔥、韭菜對(duì)DPPH·的清除率分別達(dá)到95%，85%，60%和40%以上，因此DPPH·清除率大小順序?yàn)椋捍笏?洋蔥>大蔥>韭菜；相同體積下，大蒜對(duì)DPPH·的清除率稍高于洋蔥，而達(dá)到韭菜的1.8倍左右，顯示了較強(qiáng)的DPPH·清除能力。總體來(lái)說(shuō)，4種蔥屬植物對(duì)DPPH·都有一定的清除作用，但效果區(qū)別明顯，其中大蒜的清除效果較強(qiáng)，韭菜的較弱。

3.2 4種蔥屬植物對(duì)O2-·的清除能力

根據(jù)2.3進(jìn)行操作，4種蔥屬植物對(duì)O2-·的清除率結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 4種蔥屬植物醇提物的O2-·清除率Fig.2 The superoxide anion radical scavenging rates of ethanol extracts among four Allium species

由圖2可知，大蒜、洋蔥、大蔥、韭菜對(duì)O2-·的清除率在一定濃度范圍內(nèi)均隨濃度增大而升高，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中4種蔥屬植物0.2 mL時(shí)的O2-·清除率約為1.0 mL時(shí)的50%。體積相同時(shí)，4種蔥屬植物的O2-·清除率大小順序?yàn)椋捍笏狻盅笫[>大蔥>韭菜，對(duì)O2-·的清除率均達(dá)到60%以上；其中大蒜和洋蔥對(duì)O2-·的清除率相當(dāng)，均超過(guò)90%，而具有顯著的O2-·清除活性，而大蔥和韭菜分別達(dá)到大蒜O2-·清除活性的80%和65%以上，也顯示了較強(qiáng)的O2-·清除能力。

3.3 4種蔥屬植物對(duì)·OH的清除能力

根據(jù)2.4進(jìn)行操作，4種蔥屬植物對(duì)·OH清除率結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 4種蔥屬植物醇提物的·OH清除率Fig.3 The hydroxyl radical scavenging rates of ethanol extracts among four Allium species

由圖3可知，4種蔥屬植物對(duì)·OH均具有明顯的清除能力，且隨濃度增大而升高，存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。體積相同時(shí)，4種蔥屬植物對(duì)·OH清除率大小順序?yàn)椋捍笏狻菅笫[>大蔥>韭菜。其中，不同體積的大蒜對(duì)·OH的清除能力均高于77%，在1.0 mL時(shí)達(dá)到99%；洋蔥的·OH清除活性稍低于大蒜，在1.0 mL時(shí)也達(dá)到95%以上。相比而言，清除能力較弱的為大蔥和韭菜，其對(duì)·OH的清除率分別為65%和50%。總的來(lái)說(shuō)，大蒜和洋蔥具有極強(qiáng)的OH·清除能力。

3.4 4種蔥屬植物總還原能力

根據(jù)2.5進(jìn)行操作，4種蔥屬植物總還原能力結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 4種蔥屬植物醇提物的總還原能力大小Fig.4 The total reducing capacities of ethanol extracts among four Allium species

由圖4可知，4種蔥屬植物均具有一定的還原能力，且隨濃度升高而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性；總還原能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋捍笏?洋蔥>大蔥≈韭菜。特別是大蒜醇提液的體積達(dá)到0.6 mL后其總還原能力顯著上升，明顯高于其他3種樣品液；體積為1.0 mL時(shí)，大蒜的總還原能力約為洋蔥的2倍、大蔥和韭菜的3倍，顯示了較強(qiáng)的還原能力，可能是由于溶液中含有其他氧化成分[13]；而大蔥和韭菜的總還原能力在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)相當(dāng)，相對(duì)大蒜較弱。

4 結(jié)論

采用4種體外抗氧化模型，考察和比較了大蒜、洋蔥、大蔥、韭菜的醇提液的抗氧化能力。結(jié)果顯示：4種蔥屬植物均具有不同程度的體外抗氧化活性，并呈現(xiàn)一定的量效依賴關(guān)系。綜合分析可知，大蒜、洋蔥、大蔥、韭菜的抗氧化活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋捍笏?洋蔥>大蔥>韭菜。值得注意的是，大蒜在總還原能力方面顯示了很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，而洋蔥在3種自由基的清除方面也表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力，原因可能與其植物中所含的黃酮量稍高有關(guān)，并有待做進(jìn)一步的研究。上述結(jié)果說(shuō)明，大蒜和洋蔥具有良好的體外抗氧化活性，具有深度開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]李璐,姚美,張華峰,等.3種蔥屬蔬菜水提物、醇提物與多糖的抗氧化活性研究[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,43(3):98-103.

[2]姑麗米熱·艾則孜,帕提曼·阿布都熱合曼,古麗波斯坦·多力昆.幾種蔥屬植物的營(yíng)養(yǎng)成分比較分析[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2016,22(9):68-71.

[3]尤亞林,李慧,潘思軼,等.細(xì)香蔥提取物對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901抑制作用[J].食品科學(xué),2017,38(3):176-181.

[4]Bursal E K,Ksal E.Evaluation of reducing power and radical scavenging activities of water and ethanol extracts from sumac (RhuscoriariaL.) [J].Food Research International,2011,44(7):2217-2221.

[5]Zhang H F,Zhang X,Yang X H,et al.Microwave as assisted extraction of flavonoids from cultivatedEpimediumsagittatum:extraction yield and mechanism, antioxidant activity and chemical composition[J].Industrial Crops and Products,2013,50(5):857-865.

[6]Florian C,Reinheld C.Function properties of anthocyanins and betalains in plants food and in human nutrition [J].Trends in Food Science and Technology, 2004,15(1):19-38.

[7]韋獻(xiàn)雅,殷麗琴,鐘成,等.DPPH·法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2014,35(9):317-322.

[8]郭奎彩,胡國(guó)華.超聲提取韭菜籽總黃酮及其抗氧化活性研究[J].中國(guó)食品添加劑,2014(4):47-52.

[9]王鳳舞,沈心荷,任嘉瑋,等.香菇多糖抗氧化增效劑的研究[J].食品科技,2014(6):194-198.

[10]陳洪彬,鄂昱瑾,溫美欽,等.龍須菜抗氧化肽的制備及其體外抗氧化活性[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào),2015,33(2):43-47.

[11]李麗,阮金蘭,錢偉亮,等.多指標(biāo)評(píng)價(jià)核桃蛋白及多肽的抗氧化活性[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2017,38(3):1-4.

[12]何玲玲,王新,石中亮,等.醇提板栗殼色素對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,34(10):2054-2058.

[13]武宇芳,喬麗鈞,趙二勞.大蒜提取物中總酚含量及其抗氧化活性研究[J].江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然學(xué)科版),2011,35(6):570-572.