醬油曲發酵魚露工藝的研究

李河,李建科

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，西安 710119)

魚露在我國也稱為魚醬油，早在春秋戰國時期已有記載，是我國廣東、福建等地及東南亞等國家和地區喜食的調味品之一，具有獨特的風味，在這些國家和地區也有較大規模的生產。在不同的國家和地區，使用的原料和生產工藝也各不相同，本研究所制魚露利用在魚制品生產中廢棄的魚頭、魚骨、內臟、皮和尾等淡水魚下腳料，它們總量約占全魚的40%～55%[1]。若處理不當，不但對環境造成嚴重破壞，并且還使大量的寶貴資源得不到充分利用。如在魷魚內臟中含有20%～30%的粗脂肪，對其脂肪酸成分進行氣相色譜分析表明：不飽和脂肪酸占86%，ω系列脂肪酸占37%，其中EPA占12%，DHA占24%[2]。鰱魚魚頭、魚皮和魚骨刺混合物中蛋白質含量達14%，油脂為9.22%；鰻魚骨、鰻魚頭等廢棄物中含有豐富的蛋白質、磷脂質、軟骨素和維生素等[3]。因此，將魚類下腳料充分利用，制成營養價值高的附加產品，不僅可以提高經濟效益，還對自然環境的保護起到積極作用。

前期研究結果表明低鹽淡水魚露發酵的最佳條件為：加水比0.5∶1、食鹽8%、醬油曲20%。將發酵混合物裝入容器中封口后，置于40 ℃恒溫培養箱，每天攪拌1次，發酵時間為30天，此時其已經產生魚露的醬香風味[4-8]。將發酵成熟的魚露于90 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后于5000 r/min離心25 min，取澄清液再經濾紙過濾后，即得到魚露樣品。本研究從發酵的第1日算起，在發酵過程中的第1，5，10，15，20，25，30天進行定期取樣測定，測定的指標為氨基酸態氮、總酸、鹽、揮發性鹽基氮、無鹽固形物、總氮含量、非酶褐變指數和pH值共8項，對所得數據進行處理，并對其變化進行分析[9-12]。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

淡水魚下腳料：包括魚頭、魚尾、魚骨、內臟等；甲醛溶液：體積百分數為36%；0.05 mol/L氫氧化鈉標準溶液(將0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液準確稀釋1倍)；此外，還有許多指示液等物品。

0.100 mol/L硝酸銀標準滴定溶液：取硝酸銀固體17.5 g，加入少量水使其完全溶解，定容至1000 mL，混合均勻，避光存放。

淀粉指示液：稱取0.5 g可溶性淀粉，加少量水，攪拌均勻后慢慢倒入100 mL沸水中，邊倒邊攪拌，煮沸2 min，涼至室溫以備用。此指示液應臨時配制。

熒光黃指示液：取0.5 g熒光黃固體，加入乙醇溶液使其完全溶解后稀釋至100 mL。

50 g/L鉻酸鉀溶液：取5 g鉻酸鉀固體用少量水完全溶解后定容至100 mL。

0.6 mol/L高氯酸：量取50 mL高氯酸后加水定容至1000 mL，搖勻。

30 g/L氫氧化鈉溶液：加入適量水溶解于30 g氫氧化鈉中，放至室溫后加水至1000 mL。

0.01 mol/L鹽酸標準溶液：量取濃鹽酸0.85 mL定容至1000 mL后搖勻。

30 g/L硼酸吸收液：在1000 mL水中加入30 g硼酸使其完全溶解。

10 g/L酚酞指示劑：量取1 g酚酞指示劑在100 mL的95%的乙醇中完全溶解。

混合指示劑：將1份2 g/L甲基紅乙醇溶液與1份1 g/L甲基藍乙醇溶液臨用時混合。

混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液配合，臨時混用。

混合試劑：1份硫酸銅與3份硫酸鉀混合。

95%～98%濃硫酸。

2%硼酸溶液：稱取2 g硼酸，加水溶解定容至100 mL。

40%氫氧化鈉溶液：稱取40 g氫氧化鈉，溶于60 mL水中。

0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液：按GB/T 601-2016規定的方法配制和標定。

1.1.2 儀器

SPX-100B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計 天美(中國)科學儀器有限公司；TDL-5A型低速自動平衡離心機 金壇市水北創興儀器廠；電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；79HW-1型恒溫磁力拌器、 HH-4型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸態氮的測定(甲醛滴定法)

取樣品(魚露)5.0 mL放入100 mL容量瓶后定容，混合均勻后取20.0 mL，加入60.0 mL水，將玻璃電極和甘汞電極插入樣品中后啟動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準液滴定至pH為8.2。

加入10.0 mL甲醛溶液后用氫氧化鈉標準液滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標準液的毫升數。

取80 mL水用氫氧化鈉標準液滴定至pH為9.2，同時做空白試驗。

1.2.2 總酸的測定(中和滴定法)

在100 mL容量瓶中放入5.0 mL樣品，加水稀釋至刻度后混合均勻，吸取20.0 mL，放入200.0 mL燒杯中，加入60.0 mL水，將玻璃電極和甘汞電極放入樣品后啟動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準滴定，直至酸度計指示pH為8.2。記錄氫氧化鈉標準滴定溶液(0.05 mol/L)毫升數的用量，便能夠計算總酸含量。

量取80 mL水，用氫氧化鈉標準滴定溶液(0.05 mol/L)將樣品調整至pH為8.2。同時做試劑空白試驗。

1.2.3 食鹽含量的測定(硝酸銀滴定法)

在200 mL錐形瓶中放入2.0 mL樣品稀釋液，加入1 mL鉻酸鉀溶液和100 mL水，混合均勻，用硝酸銀標準溶液滴定至初顯橘紅色。

用量筒取100 mL水，并做空白試驗。

1.2.4 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定(半微量定氮法)

在均質杯中放入10 g樣品，隨后放入90 mL高氯酸，均質2 min后可使其離心分離。

在錐形瓶中放入10 mL硼酸吸收液，加入幾滴混合指示劑，并將錐形瓶放在半微量定氮儀蒸餾冷凝管的下方，讓它下端能夠置于硼酸吸收液的液面下。

在半微量定氮儀反應室中注入精確量取的5 mL樣品濾液，并同時加入1～2滴酚酞指示劑和5.0 mL氫氧化鈉溶液，隨后快速夾緊橡膠皮管，同時在入口處加少量防止漏氣。

加熱進入蒸汽以蒸餾，5 min后把冷凝管的下端轉移出錐形瓶內吸收液的液面外，隨后再蒸餾1 min，用適量水淋洗冷凝管下端，水接入錐形瓶中。

錐形瓶內的吸收液用鹽酸標準溶液滴定至溶液呈藍紫色為終點。同時用5.0 mL高氯酸取代樣品中的濾液進行空白對照。

1.2.5 無鹽固形物的測定(烘干法)

在100 mL容量瓶中放入10.00 mL樣品試液，加水溶解至刻度后搖晃均勻。在已烘干至恒重的稱量瓶中加入以上稀釋液5.00 mL，轉移至105 ℃電熱恒溫干燥箱內，把瓶蓋斜放在瓶邊。烘4 h后，蓋上瓶蓋，取出，轉移至干燥箱中，降至室溫后稱重。繼續烘0.5 h，冷卻，稱重，直到2次稱重相差不超過1 mg，視為恒重。此時可得到可溶性總固形物的含量。

用樣品中可溶性總固形物的含量減去樣品中氯化鈉的含量，即可得到可溶性無鹽固形物的含量。

1.2.6 總氮含量(T-N)(凱氏定氮法)

1.2.6.1 消化

在干燥的消化瓶中放入2.0 mL樣品，隨后加入2 g硫酸銅和硫酸鉀混合試劑、15 mL濃硫酸，置于通風櫥中加熱(消化瓶口放置小漏斗，將消化瓶45°斜放在電爐上)。當內含物悉數炭化、泡沫全部停止后，繼續使消化瓶內溶液微沸。直至炭粒完全消失，消化液為澄清的淺綠色，繼續加熱15 min，取出，待降至室溫，徐徐加水定容至100 mL備用。

1.2.6.2 蒸餾

把冷凝管末端的導管沒入裝有10 mL 2%硼酸溶液和1～2滴混合指示液的錐形瓶的液面內，吸取10 mL消化稀釋液，隨凱式燒瓶瓶壁慢慢加入凱氏定氮儀內，同時加入10 mL 40%氫氧化鈉溶液，快速連接蒸餾裝置(整個裝配應嚴密不漏氣)，開通冷凝水，搖晃凱氏燒瓶，將錐形瓶的位置放低，使冷凝管末端與液面分離，再蒸餾1 min，停止加熱。用適量水淋洗冷凝管末端的外部，取出錐形瓶。

1.2.6.3 滴定

用0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液滴定收集液至紫紅色為終點，記錄消耗0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液的毫升數，同時做空白試驗。

1.2.7 非酶褐變指數(Hendel法)

5 mL的樣液用50 mL 50%的乙醇提取1 h，期間不斷攪拌。提取液經過濾紙過濾。將分光光度計調整至420 nm，取適量濾液在此處測定吸收值。

1.2.8 pH值測定(pH酸度計)

取適量樣品，將經過校正的pH計插入樣品中，期間不斷攪拌樣品，待pH計讀數穩定后便可記下數據。

2 試驗結果及數據分析

上述實驗均進行3次平行實驗，取平均值，所得原始數據和變化圖用Excel計算并制出。

2.1 氨基酸態氮

氨基酸態氮含量的變化見圖1。

圖1 氨基酸態氮含量的變化

由圖1可知，氨基酸態氮的含量隨著發酵天數的不斷增加而增多，在發酵時間的前5天內，氨基酸態氮的含量增加速度最快，之后的發酵時間里增長速度趨于平緩，氨基酸態氮增長速度越平穩，表示發酵完成程度越高。由于在發酵初期，蛋白質分解作用明顯，此時氨基酸態氮也快速增加，隨著發酵的進行，魚露中的蛋白質分解酶逐漸失去活性，故氨基酸態氮的增加就緩慢下來。

2.2 總酸含量

總酸的變化見圖2。

圖2 總酸的變化

由圖2可知，在發酵的前5天時間里，總酸度下降趨勢明顯；在發酵的第5～25天時間里，總酸的含量不斷上升，第25天至發酵結束，總酸的含量又略微有所下降。總酸含量的變化可能是由于發酵過程中微生物產酸量和產生的堿性揮發性鹽基氮成分相互作用的結果。另外，發酵初期菌體利用糖類分泌酸，醬油曲加入以后，由于耐鹽性乳酸菌Pediococcussp.的增殖而使醪中的 pH值隨之下降，而醪中的總酸量也隨著增加。

2.3 食鹽含量

食鹽含量的變化見圖3。

圖3 食鹽含量的變化

由圖3可知，樣品在發酵時間為前15天時，食鹽含量增長較快；發酵時間在第15～20天時，食鹽含量增長速度減緩；發酵時間在第20～25天時，食鹽含量有所下降；第25天至發酵結束，食鹽含量又有所上升，總趨勢是趨于平穩，最終食鹽含量約為11.01 g/dL。發酵過程中的發酵溫度造成魚露水分的揮發和魚露中鹽類物質的生成，都會造成樣品中食鹽含量的增加。

2.4 揮發性鹽基氮(TVB-N)

揮發性鹽基氮含量的變化見圖4。

圖4 揮發性鹽基氮含量的變化

由圖4可知，在前5天的發酵時間內，揮發性鹽基氮含量大幅度上升；發酵時間為第5～20天時，含量不斷下降；第20天至發酵結束，揮發性鹽基氮含量有所回升，但含量始終處在較低水平。加入醬油曲后，曲中的有益菌大量繁殖并處于優勢地位，很大程度上抑制了腐敗菌的繁殖，使得揮發性鹽基氮含量不斷下降，可見加入醬油曲對于魚露產品的保藏和產品品質的提升具有良好效果。

2.5 無鹽固形物

無鹽固形物含量的變化見圖5。

圖5 無鹽固形物含量的變化

由圖5可知，樣品中的無鹽固形物含量在發酵的前5天呈現上升的趨勢；發酵時間的第5～15天時，含量有所下降；發酵時間在第15～20天時，含量上升幅度較大；在發酵時間為第20～25天時出現了明顯下降，下降幅度大于發酵20天時所上升的幅度；第25天至發酵結束又有所回升。無鹽固形物中的主要成分是蛋白質、氨基酸、肽、糖類和有機酸等物質，樣品中無鹽固形物的不穩定變化是由于隨著發酵時間的變化，樣品中的蛋白質、氨基酸和糖類等物質含量的變化造成的。

2.6 總氮含量

可溶性總氮含量的變化見圖6。

圖6 可溶性總氮含量的變化

總氮含量可表現出魚露產品品質的優劣，溶出的氮含量越高，表示魚露產品的質量越好。由圖6可知，在第1～10天的發酵時間內，可溶性總氮的含量逐漸增加，第10～20天的發酵時間內可溶性總氮有所下降，從第20天至發酵結束可溶性總氮的含量又開始上升。實驗過程中可溶性總氮增加的原因主要是原料蛋白質不斷被蛋白酶水解成可溶性的肽類及氨基酸成分；可溶性總氮下降的原因可能是某種成分的活性增強，抑制了蛋白酶的水解，而隨著發酵時間的增加，其抑制能力減弱，可溶性總氮含量又恢復上升趨勢。

2.7 非酶褐變指數

非酶褐變指數的變化見圖7。

圖7 非酶褐變指數的變化

由圖7可知，發酵過程中非酶褐變程度隨著發酵時間的延長不斷升高，非酶褐變主要是由美拉德反應產生，隨著非酶褐變指數的增加，魚露的顏色由最初的淡褐色變為最后的深褐色。由于取樣時要經過高溫處理，因此其本身會產生褐變反應，魚露中含有的糖類、蛋白質或氨基酸，在加熱過程中迅速產生褐色素。Yaylaian 指出食物原料經高溫高壓處理時，會產生褐變反應，食物系統中含有還原糖及蛋白質或氨基酸，在加熱過程中，迅速反應產生褐色素。

2.8 pH值

pH值的變化見圖8。

圖8 pH值的變化

由圖8可知，在開始發酵的前5天時間內，pH呈現上升趨勢；在第5～25天的發酵時間內，pH不斷下降；從第25天到發酵結束，pH又有所上升。在開始發酵的前5天時間內，樣品中的堿性揮發性鹽基氮類物質生成量較多，造成pH的上升；在第5～25天的發酵時間內，來自魚內臟和醬油曲中的產酸微生物活躍，產酸較多，使pH不斷下降；發酵后期由于米曲霉將蛋白質分解成小分子的胺、氨等堿性物質的產量大于其產生的酸的產量，導致pH有所上升。

3 結語

本實驗所制得魚露產品經30天發酵后，最終的各項指標為氨基酸態氮含量1.25 g/dL；總酸含量1.70 g/dL；食鹽含量11.01 g/dL；揮發性鹽基氮含量182 mg/dL；可溶性總氮含量0.212 g/dL；無鹽固形物含量10.8 g/dL；非酶褐變指數0.948；pH值5.09。根據魚露行業標準SB/T 10324-1999，氨基酸態氮指標已超過一級標準，可溶性總氮和食鹽含量與標準相比還比較低。實驗過程中揮發性鹽基氮含量在不斷下降，符合魚露的生產要求。

傳統魚露生產方法耗時長且原料多為魚蝦等，對利用淡水魚下腳料經醬油曲速釀魚露生產的研究，將資源最大程度地利用起來，變廢為寶，節約資源，減輕環境污染，因魚露具有獨特風味，深受廣大沿海居民的喜愛，因此具有廣闊的市場前景和經濟價值，值得不斷進行深入研究和探討。

參考文獻：

[1]龔鋼明,顧慧,蔡寶國.魚類加工下腳料的資源化與利用途徑[J].中國資源綜合利用,2003(7):23-24.

[2]童軍鋒,張英.加強魷魚資源的加工和綜合利用技術研究[J].東海海洋,2001,19(4):46-50.

[3]賴海濤,黃志勇,涂開生.酶法提取烤鰻下腳料水解動物蛋白的研究[J].集美大學學報(自然科學版),2002,7(1):11-14.

[4]黃椿鑒,傅紅,汪少蕓,等.魚露外加酶工藝的探討[J].福州大學學報(自然科學版),1997,8(4):25.

[5]陳有容,張雪花,齊鳳蘭,等.白鰱廢棄物發酵魚露的成份分析及評價[J].中國水產,2002(4):73.

[6]何雪蓮,羅非魚加工下腳料發酵生產魚露的研究[D].海口：華南熱帶農業大學，2007.

[7]張雪花,陳有容,內田基晴,等.鰱及其加工廢棄物發酵魚露的比較[J].上海水產大學學報,2000,9(3):226-230.

[8]候溫甫,黃澤元,汪秀文,等.淡水魚加工下腳料速釀低鹽魚露的工藝研究[J].食品科學，2009,30(23):322.

[9]毋瑾超,朱碧英,胡錫鋼,等.魚肉液體制曲的工藝條件[J].湛江海洋大學學報,2002,22(3):33-37.

[10]陳倉林.魚露的天然發酵工藝[J].傳統釀造,2001,113(3):39-40.

[11]孫美琴.魚露的風味及快速發酵工藝研究[J].現代食品技,2006,22(4):280-283.

[12]陳瑜珠,陶紅麗,曾慶孝,等.利用羅非魚加工下腳料發酵魚露的研究[J].現代食品科技,2008,24(5):441-443.