RNAi介導的CK2α基因沉默對喉癌細胞上皮間質轉化過程的影響

張芳 楊博 杜莉 姜學鈞

1中國醫科大學附屬第四醫院耳鼻咽喉科（沈陽110032）；2中國醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科（沈陽110001）

喉癌是人類頭頸部常見的惡性腫瘤［1］，臨床治療方式主要包括放療和化療［2?3］，但治療產生的毒副作用嚴重影響患者生存質量且預后不佳，目前缺乏針對喉癌的有效靶向藥物。因此，有必要研究喉癌發生過程中的關鍵調節靶點。蛋白激酶2（CK2）是真核細胞中普遍存在的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白激酶，全酶為一異構四聚體，是由2個催化亞基（α或α′）和2個調節亞基（β）構成，現已明確的底物有300余種［4］。在頭頸部惡性腫瘤、肺癌、消化系統腫瘤、男性泌尿生殖系瘤、女性生殖系統腫瘤、惡性黑色素瘤、血液系統惡性腫瘤中，CK2的表達水平和活性明顯增高，不僅與腫瘤細胞擴散能力、癌癥預后相關，還反映其病理生理學特征［5］。然而，CK2α對人類喉癌發展的相關精確調節機制仍未明確。

研究顯示，上皮間質細胞轉化（epithelial mes?enchymal transition，EMT）過程的發生在腫瘤的轉移浸潤中扮演了重要角色。ZOU等［6］的研究表明在大腸癌組織中CK2α的表達升高，可以通過調控EMT相關基因的表達促進大腸癌細胞的侵襲轉移。因此，筆者通過短發卡RNA（shRNA）介導的基因沉默技術，利用Hep?2細胞研究CK2α在喉癌發病機制中的角色，以探討CK2α對喉癌細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人喉癌Hep?2細胞購自美國標準培養收集所（ACTT，Manassas，VA，USA）。

1.1.2 主要儀器及試劑 Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel膠（美國BD公司）；Eagle培養基和胎牛血清（美國GIBCO公司）；G418、Lipo?fectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；RNA試劑盒（北京天根生化科技有限公司），逆轉錄酶試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）；IX71光學顯微鏡和DP70數字照相機（日本Olympus公司）；西式蛋白印跡檢測系統（美國Millipore公司）；NP?40裂解液（碧云天生物技術研究所）β?actin，CK2α，上皮鈣黏蛋白E?cadherin，snail，slug，vimentin，twist抗體均來自圣克魯斯生物技術，pGCsi?H1?CK2α、pGCsi?H1?control質粒由沈陽萬類生物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人喉癌Hep?2細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素經Dulbecco改進的Eagle培養基培養，置于37℃，5%CO2飽和濕度的溫箱中培養。

1.2.2 質粒構建和穩定轉染 根據GenBank報道的蛋白激酶CK2α的核苷酸序列（No.NM 177560.2）和shRNA設計原則，HindIII和BamHI酶切pGCsi?H1 質粒載體（pGCsi?H1?CK2α），其序列信息如下：正義鏈：gatccccACT?GCTGCGATATGAC?CACttcaagagaGTGGTCATATCGCAGCAGTttttt；反 義鏈：agctaaaaaACTGCTGCGATATGACCACtctcttgaaGT GGT?CATATCGCAGCAGTggg。亂序shRNA也被合成并亞克隆進入pGCsi?H1載體，構建陰性對照質粒（pGCsi?H1?control）。重組體載體的準確性通過嚴格的酶分析法及測序來確定。

為獲取喉癌細胞系穩定表達CK2α shRNA，將Hep?2細胞接種于6孔板中，用培養液調整細胞密度為2×105，培養24 h，其融合達70%時用Lipo?fectamineTM2000?分別轉染 pGCsi?H1?CK2α、pGCsi?H1?control質粒，具體操作按說明書進行。用G418（600 g/mL）篩選穩定轉染的細胞，將獲得的克隆細胞保存于含G418（350 g/mL）的介質中繼續培養、傳代。實驗分為3組：未轉染組（parental）、對照質粒轉染組（pGCsi?H1?control）和干擾質粒轉染組（pGCsi?H1?CK2α）。

1.2.3 定量實時聚合酶鏈反應檢測CK2α表達 使用總RNA試劑盒提取總RNA，并溶解于無RNA酶的水中。純化RNA的A260/A280比值在1.6～1.8之間。使用超級M?MLV逆轉錄酶試劑盒（BioTeke，Beijing，China）將RNA樣本逆轉錄合成cDNA。使用ExicyclerTM 96檢測CK2α的蛋白表達及 mRNA 表達水平并利用 2?ΔΔCT（Livak and Schmittgen，2001）分析相應的數據，以β?actin（肌動蛋白）為內參照。定量實時PCR所用引物如下：CK2α正義鏈：5?CCTGGATTATTGTCACAGCA?3；反義鏈：5?AAGTATCGGGAAGCAACTCG?3；β?actin正義鏈：5?CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG?3；反義鏈：CTGTCACCTTCAC?CGTTCCAGTTT。

1.2.4 細胞形態觀察 將轉染后獲得的穩定轉染細胞系及對照細胞系調整細胞密度接種于孔板內，置于37℃，5%CO2的培養箱內培養。培養24 h后將細胞孔板取出，置于倒置顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.5 細胞遷移和侵襲評估 采用包含8 μm細孔的聚碳酸酯濾器Transwell小室檢測細胞的遷移和侵襲。在遷移分析中，上室平鋪1×104懸浮于200 μL無DMEM介質血清中的細胞，下室填滿完全培養基。侵襲實驗中，將細胞加入上室鋪20 μL Matrigel膠（1 mg/mL）并在37℃下孵育2 h。24 h后，輕柔吸出室內的介質，使用棉拭子去掉過濾器上層面的細胞或Matrigel。過濾器下層的細胞固定于4%的多聚甲醛中20 min并用蘇木精染色3 min。用IX71光學顯微鏡（200×）計數小室中5個隨機區域內遷移及侵襲的細胞數目，使用DP70數字照相機照相，并記錄平均值。

1.2.6 免疫蛋白印跡（Western blot）檢測E?cad?herin、vimentin及轉錄因子slug、snail的表達 使用NP?40裂解液從細胞中提取蛋白，將等量的蛋白標本溶解于十二烷基磺酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）分離并且遷移至氟聚偏乙烯（PVDF）膜，加適當的抗體（β?actin，CK2α，上皮鈣黏蛋白 E?cadherin，snail，slug，vimentin，twist）、4℃過夜。然后清洗并加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。使用西式蛋白印跡檢測系統分析。

1.3 統計學方法 實驗數據結果采用±s表示，用SPSS 17.0統計軟件進行單因素方差分析，用t檢驗分析兩組間差異，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 shRNA介導的Hep?2細胞中穩定敲低了CK2α 與對照質粒轉染組相比，干擾質粒轉染組細胞中CK2α蛋白表達顯著下降了77%（圖1A，P＜0.001）；CK2α mRNA的表達下降了78%（P＜0.001，圖1B）。這些結果說明，針對CK2α的干擾質粒能夠有效抑制Hep?2細胞中轉錄控制及翻譯水平CK2α的表達。

2.2 干擾質粒轉染組細胞的上皮極性未喪失 相差顯微鏡下觀察顯示與parental組相比，轉染pGC?si?H1?control與pGCsi?H1?CK2α后的細胞形態并未發生明顯的變化。細胞排列緊密，形態主要為三角形以及多邊形的上皮細胞形態，僅有少數變得狹長，細胞的上皮極性并未大量喪失（圖2）。

圖1 干擾質粒轉染組中CK2α的表達抑制Fig.1 Inhibition of CK2α expression in plasmid transfection group（n=3）

圖2 顯微鏡觀察細胞的形態Fig.2 Microscopic observation of cell morphology

2.3 穩定抑制了CK2α減弱了Hep?2細胞的遷移和侵襲 用Transwell試驗檢測Hep?2細胞的遷移和侵襲能力，如圖3A所示，與對照質粒轉染的細胞相比，抑制內源性CK2α的表達，遷移的細胞幾乎減半（P＜0.001）。在干擾質粒轉染的細胞中，也觀測到了侵襲相似細胞數目的下降（P＜0.001，圖3B，與對照質粒轉染組相比）。以上結果說明，敲除CK2α降低了試管內人喉癌的遷移和侵襲能力。Transwell實驗分別使用無膠包被和有matrigel膠（基質膠）包被的小室，以測量CK2α抑制對細胞遷移和侵襲的影響。在干擾質粒轉染的喉癌細胞中，Hep?2細胞的遷移和侵襲數目均顯著下降（n=5，與對照質粒轉染細胞相比，P＜0.001。圖中刻度條 =100 μmol/L）。

2.4 穩定敲除了CK2α的表達增加了Hep?2細胞中E?cadherin的表達但是減低了vimentin的表達 癌在發生、進展過程中失去了絕大部分的上皮特征，而且不同癌癥細胞系在試管內經歷了部分或完全的EMT。因此，我們通過檢測EMT相關因子的表達來測試CK2α在Hep?2細胞EMT過程中的作用。結果說明，在CK2α耗盡的細胞中，E?cadherin、上皮標記物蛋白表達顯著增加（圖4，P＜0.01，與對照質粒轉染組相比）；反之，snail、slug和E?cadherin特異性轉錄抑制體的表達下降（圖4，P＜0.001，與對照質粒轉染組相比）。當CK2α下調時，vimentin蛋白（間葉細胞特征性蛋白）水平在下降（圖4，P＜0.05，與對照質粒轉染組相比）。以上結果說明，穩定敲除CK2α的表達通過調節EMT過程相關因子的表達來抑制人喉癌EMT的發生。

圖3 穩定敲除CK2α減低了Hep?2細胞的遷移和侵襲Fig.3 Stable knockout of CK2α reduces Hep?2 cell migration and invasion

圖4 各組細胞EMT相關蛋白的表達變化Fig.4 Changes of EMT related protein expression in each group of cells

3 討論

本研究通過使用shRNA介導的RNA干擾作用，探討了CK2α對人喉癌的影響。首先確定CK2α特異干擾質粒能夠有效抑制Hep?2細胞中內源性CK2α在轉錄控制及翻譯水平的表達，提供了進一步研究的實驗基礎。Transwell實驗研究顯示，CK2α干擾質粒轉染能顯著抑制喉癌細胞的遷徙和轉移。

EMT是指上皮細胞在特定的情況下通過特定程序向間質細胞轉化的過程，在腫瘤細胞的遷移侵襲過程中扮演著重要的角色，是腫瘤細胞轉移的重要因素之一。在癌癥發展過程中，EMT促使上皮細胞失去其顯型并導致間質轉化，且可以從原發瘤播散［7?10］。因此，研究EMT 過程的發生機制可以對惡性浸潤腫瘤治療提供新的治療靶點。

CK2α過表達能活化小鼠乳腺的EMT，因此導致雌性乳腺的數目增生及發育障礙［5］。另一方面，CK2α抑制劑CX?4945阻止了轉化生長因子be?ta?1（TGF?β1）誘發人肺腺癌細胞的EMT［11］。以上兩點說明，CK2α可能通過調整EMT進程促進癌癥發生。然而CK2α是否通過調節EMT而參與喉癌仍未明確。為了進一步檢測RNAi表達載體介導的CK2α沉默對腫瘤轉移能力的影響，筆者檢測了普通Hep?2細胞和針對CK2α的干擾質粒作用后的EMT相關蛋白的表達水平，包括E?cadherin、slug、snail和vimentin。E?cadherin是存在于正常上皮細胞中的一種鈣依賴性細胞黏附分子，有利于維持細胞上皮極性和完整性［12?13］。E?cadherin的減少使細胞間的黏附性減弱，癌細胞易發生脫落而發生癌轉移［14］。E?cadherin表達的降低是EMT過程發生的關鍵環節。Vimentin首次發現于間充質細胞中，具有維持細胞結構與組織完整的作用，與癌癥的侵襲表型顯著相關［15］。Snail能與 E?cad?herin結合，下調E?cadherin的表達，從而促進EMT過程的發生與腫瘤轉移［16］。Slug作為Snail家族中的一員，含有高度保守的鋅指結構域，同樣能夠通過下調E?cadherin的表達，促進EMT過程的發生［17］。本研究中，在Hep?2細胞中抑制CK2α，增加了E?cadherin的表達，然而卻降低了slug、snail和vimentin的表達，這表明敲除CK2α通過抑制EMT過程來減低體外實驗中喉癌細胞的遷移和侵襲。

本研究提供的證據說明，穩定敲低CK2α抑制了人喉癌細胞的遷移和侵襲。CK2α可以考慮作為喉癌發生過程中一個關鍵調節的候選靶點。

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