不同處理方法對蕪菁游離小孢子出胚率的影響

賈 凱，吳 慧，許 建，高 杰

（新疆農業大學林學與園藝學院，新疆烏魯木齊830052）

蕪菁（Brassica rapa L.）屬十字花科蕓薹屬2年生根菜類蔬菜。在新疆維吾爾語中稱恰麻古，是維吾爾族居民食藥兩用的傳統蔬菜［1］。目前，新疆地區所栽培的蕪菁品種混雜，多為農戶自行留種后育成的農家品種，由于這些農家品種存在提早抽薹現象嚴重且容易遭受病蟲害，因此選育新的雜交品種已成為蕪菁育種的主要方向。選育新的雜交品種需要純合的親本進行雜交，獲得純合的親本一般通過常規技術進行多代自交，此方法耗時長、效率低。利用游離小孢子培養方法，可在1～2年內獲得穩定的純合自交系，縮短育種周期，提高育種效率［2］。因此，游離小孢子培養技術是蕪菁育種的一條有效途徑。

有關游離小孢子培養技術方面前人做了許多研究，其中，Lichter利用小孢子培養技術首次在甘藍型油菜上成功地獲得再生植株［3］；Sato等通過大白菜游離小孢子培養形成雙單倍體植株用于育種［4］；Takahata等對3種花青菜的供體植株進行低溫處理，然后再進行小孢子培養獲得胚狀體［5］；蔣武生等對蕪菁小孢子熱激處理后培養獲得胚狀體［6］；喬麗桃等對蕪菁花蕾長度與小孢子單核靠邊期的關系進行初步探究，并觀察了蕪菁小孢子胚胎發生的顯微結構［7］；王娜等研究了蕪菁花蕾大小與小孢子發育時期、小孢子胚胎發生率的對應關系［8］，但在試驗過程中發現，蕪菁胚狀體發生率較低，這為后續試驗的進行帶來不便。因此，本試驗對蕪菁小孢子胚狀體發生過程中的影響因素進行研究，以提高蕪菁小孢子出胚率，從而為新疆蕪菁的遺傳育種研究提供基礎條件。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料來源于新疆柯坪縣當地農家蕪菁品種阿恰蕪菁。2015年8月于新疆農業大學林學與園藝學院試驗田中種植蕪菁材料，將收獲的蕪菁肉質根置于4℃低溫下保存。2016年4月21日將已經通過低溫春化的肉質根種植于露地，5月8日植株陸續抽薹開花，植株生長環境溫度范圍為12～26℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 花蕾的采集與處理 于每日 08：00—10：00（采蕾環境溫度范圍為15～18℃）隨機摘取供試植株的主花序或一級分枝花序放入培養皿中，置于放有冰袋的泡沫箱中及時帶回組培實驗室。將花序上的花蕾輕輕用鑷子取下，選取處于單核靠邊期的花蕾［8］（約2.0～3.0mm）轉移到2%NaClO（含2滴吐溫乳化劑）中消毒10 min，再用無菌水沖洗3次，每次5 min?；ɡ傧炯靶℃咦佑坞x與培養的整個試驗過程均在無菌條件下完成，且所用試驗工具及液體都經滅菌后置于4℃條件預冷。

1.2.2 小孢子的游離與培養 將消毒過的花蕾置于燒杯中，并加入1 mL B5洗滌培養基（pH值5.8），用注射器活塞壓榨花蕾，釋放小孢子，通過45μm尼龍篩網過濾小孢子懸浮液。將收集的濾液用B5培養基定容至5 mL，4℃、800 r／min離心5 min，之后倒掉上清液，留下沉淀，再倒入5mL B5培養基，重新懸浮小孢子并離心，共離心3次。最后，將收集到的小孢子用1 mLNLN培養基制成懸浮液，調整小孢子密度為10萬～20萬個／mL，分裝至直徑為60 mm的培養皿中，每皿約3 mL，用Parafilm膜封口。

1.2.3 不同處理方法對小孢子胚胎發生率的影響 小孢子的高溫熱激處理：將不添加激素的NLN－13小孢子懸浮液放入恒溫箱中黑暗靜置培養，分別設置25℃（CK）、33℃、35℃共3種溫度和24、48、72 h共3種時間的熱激處理，隨后轉到25℃繼續黑暗靜置培養。

不同蔗糖濃度的培養基培養：分別用 NLN－9（蔗糖9%）、NLN－13（蔗糖13%）（CK）、NLN－15（蔗糖15%）3種不同蔗糖濃度且不含激素的NLN液體培養基懸浮培養小孢子，隨后分裝于60 mm培養皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。經33℃、24 h熱激處理后轉到25℃黑暗靜置培養。

培養基中添加6－BA和NAA培養：將小孢子沉淀物均勻懸浮于含有不同濃度 NAA（0.1、0.2、0.4 mg／L）、6－BA（0.1、0.2、0.4 mg／L）激素含量的 NLN－13培養基中，并分裝于60 mm培養皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。以不添加任何激素的NLN－13培養基作為對照組（CK）。經33℃、24 h熱激處理后轉到25℃黑暗靜置培養。

1.2.4 胚狀體的觀察 以上試驗每個處理均取20個花蕾。培養30 d后統計產胚量，并將形成的小孢子胚轉入固體培養基中培養。在培養過程中使用倒置顯微鏡觀察小孢子的變化，采用 Duncans新復極差法進行產胚量間差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 不同熱激溫度、時間處理對蕪菁胚狀體發生的影響

由表1可知，在其他培養條件相同的情況下，25℃（CK）條件下恒溫培養未出現胚狀體；熱激溫度為33℃、時間為24 h時，出胚率最高，為1.25胚／蕾，48 h后胚誘導率降至0.60胚／蕾，72 h后胚誘導率僅為0.05胚／蕾；當熱激35℃、時間為 24 h時，胚誘導率為 0.35胚／蕾，48 h時為 0.20胚／蕾。本研究過程中還發現，33℃培養條件下形成的胚狀體中子葉形胚比率最高，達到94.5%；而35℃時，子葉形胚比率僅為63.6%，這可能是由于熱激溫度過高，不適于小孢子的發育。有研究認為，熱激時間以24 h為出胚率最高，小孢子培養的前12 h是小孢子分裂的敏感期，而胚胎發生的敏感期在開始培養的24 h內［9］。由此可見，熱激處理對于蕪菁的小孢子胚胎發生是必需的，本研究得出33℃、24 h的熱激處理適用于蕪菁游離小孢子培養。

表1 不同熱激溫度、時間處理對蕪菁胚狀體發生的影響

2.2 不同蔗糖濃度對蕪菁胚狀體發生的影響

蔗糖在小孢子培養的過程中調控著培養基的營養成分和滲透壓［10］。由表2可知，13%蔗糖濃度（NLN－13）誘導率最高，為1.25胚／蕾；在蔗糖濃度為15%（NLN－15）時，出胚量相對較少，平均為0.85胚／蕾；蔗糖濃度為9%（NLN－9）時，未出現胚狀體。結果表明，當蔗糖濃度為13%（NLN－13）和15%（NLN－15）時能夠誘導出胚狀體，但13%（NLN－13）的蔗糖濃度最適于蕪菁小孢子的胚胎發生。

表2 不同蔗糖濃度對蕪菁胚狀體發生的影響

2.3 不同激素配比對蕪菁胚狀體發生的影響

由表3可知，NLN－13培養基中單獨添加6－BA時，小孢子胚誘導率較CK并無顯著提高；添加0.1 mg／L 6－BA時出胚率相對最高，達到2.10胚／蕾；高濃度的6－BA有抑制胚狀體的現象發生，當6－BA濃度為0.4 g／L時，出胚率降低到0.6胚／蕾，在所有激素處理中處于最低水平。培養基中單獨添加NAA時，出胚率顯著高于CK，隨NAA濃度增加，出胚率呈先上升后下降的趨勢，當NAA濃度為0.2 mg／L時達到最高，為8.60胚／蕾，是 CK的4.7倍，添加0.2 mg／LNAA是所有處理中能最有效提高出胚率的方法。在培養基中同時添加NAA與6－BA時，出胚率有小幅提升；當同時添加0.2 mg／L NAA和0.2 mg／L 6－BA時，蕪菁小孢子的胚胎發生率達到最高，為3.15胚／蕾；增大NAA與6－BA濃度分別到0.4 mg／L時，胚誘導率下降到1.10胚／蕾。在培養基中加入激素能有效地提高小孢子胚胎發生的頻率，但是加入激素后，胚狀體的發育狀況也受到影響。單獨添加6－BA的處理中，所誘導出的胚狀體發育不完全，畸形胚數量相對較少；單獨添加0.2 mg／L NAA時，子葉形胚占胚狀體總數的比率相對較高，達到72.1%；當NAA濃度為0.4 mg／L時，子葉形胚比率下降到 52.3%。綜上所述，在培養基中單獨添加0.2 mg／L NAA可以有效提高蕪菁小孢子胚誘導率，且子葉形胚比率相對較高。當在培養基中同時添加NAA與6－BA時，并不能使小孢子胚胎發生與發育朝著良好的方向發展。

2.4 小孢子離體發育過程

從圖1可以看出，小孢子的膨大情況各不相同，同一處理中出現了膨大的小孢子和未有變化的小孢子（圖1－A）；隨著培養時間的增加，小孢子形成細胞團（圖1－B）；細胞團發育成為胚狀體的過程為球形胚－魚雷形胚－心形胚－子葉形胚（圖1－C、圖1－D、圖1－E、圖1－F）；未含激素的培養基中產生的小孢子胚發育狀況良好（圖1－G）；添加激素后小孢子胚胎數明顯增多，但胚狀體發育情況各異，出現較多畸形胚（圖1－H）；胚狀體轉接至固體培養基后轉綠（圖1－I）。將小孢子胚接種于 B5＋0.2 mg／L 6－BA ＋0.05 mg／L NAA固體培養基上，胚狀體逐漸轉綠并開始萌發，胚狀體萌發后形成較多幼芽。然后將幼芽轉入B5＋0.2 mg／L NAA生根培養基上可以生根，形成完整植株。

3 結論與討論

目前游離小孢子培養技術在大多數蔬菜的育種工作中都得以運用，本試驗在已確定小孢子處于單核靠邊期時花蕾大小的對應關系后，主要針對南疆地區主栽農家蕪菁品種阿恰蕪菁進行誘導，探究小孢子出胚的最適條件以獲得更多數量的雙單倍體純合植株。

高溫熱激處理可以改變小孢子的發育途徑，使其不能形成成熟的花粉粒轉而向胚胎發育的途徑發展，形成小孢子胚［11］。本研究認為，33℃、24 h的高溫熱激處理對蕪菁小孢子胚胎發生是必要的，出胚率為1.25胚／蕾，而且小孢子胚的生長狀況良好，多數可發育成子葉形胚。培養基中的蔗糖一方面維持著小孢子生長發育所需要的營養物質，另一方面調節著培養基中的滲透壓［12－13］。在誘導油菜、大白菜等小孢子胚狀體過程中發現，當NLN培養基中的蔗糖濃度為13%時，小孢子胚的發生與發育狀況最好［14］，這與本研究所得結論一致。蔣武生等研究發現，不含任何激素的NLN培養基有利于胚狀體的發育［15］；朱守亮等在 NLN－13培養基中添加0.1 mg／L 6－BA和 0.05 mg／L NAA能夠誘導出高胚產量［16］；李巖等研究發現，NLN培養基中加入0.05mg／LNAA和0.05mg／L 6－BA的胚誘導率顯著高于不加入任何激素的NLN培養基［17］；戴希剛等在進行羽衣甘藍的小孢子培養試驗中發現，6－BA對胚胎發生有抑制作用［18］。本試驗結果表明，在NLN培養基中單獨添加0.2 mg／L NAA可以顯著提高小孢子出胚數，單獨添加低濃度的6－BA能夠促進蕪菁小孢子胚的發生，但效果不如NAA明顯，混合加入NAA與6－BA對小孢子胚的產生無明顯作用。同時研究發現，添加激素后小孢子的胚胎發育受到一定影響，培養過程中出現畸形胚，胚狀體到一定時期并不會再向著子葉形胚發展。本試驗研究認為，采用33℃熱激處理24 h時，在NLN－13中加入0.2 mg／L NAA是蕪菁游離小孢子的胚胎發生與發育的最佳條件。

表3 不同激素濃度對蕪菁胚狀體發生的影響

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