茶樹CsGPX基因克隆及干旱脅迫下的表達分析

喬新榮，張繼英

（信陽農林學院，河南信陽464000）

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，簡稱GPX）是生物機體內重要的抗氧化酶，它可以清除機體內的H2O2及脂質過氧化物，阻斷活性氧自由基對機體的進一步損傷，保護細胞免受氧化脅迫，提高植物的抗逆能力［1－2］。谷胱甘肽過氧化物酶也可以作為信號分子，與激素交聯，調節植物的生長發育［3－4］。因此，對谷胱甘肽過氧化物酶進行開發和利用具有重要的意義，現已從煙草、柑橘、擬南芥、大白菜、番茄、豌豆、水稻、龍眼等許多植物中分離和鑒定［5］。

茶樹［Camellia sinensis（L.）O.Kuntze］屬于山茶科雙子葉植物，茶葉具有高效的抗癌、抗衰老、抗輻射、抗氧化、清除人體自由基、降血糖和血脂等一系列藥理功能。我國茶區地形分布復雜，包括平原、丘陵、山地和高原。這些地區經常出現季節性干旱、高溫、低溫等逆境，導致茶芽萌發遲、生長瘦弱，造成茶產量和品質下降。本研究擬克隆茶樹CsGPX基因，并對其進行生物信息學方面及干旱脅迫下的轉錄表達進行初步分析，旨在為今后通過基因工程研究CsGPX基因的表達，探究茶樹依賴CsGPX途徑清除活性氧的分子基礎，以期為鑒定和選育茶樹抗逆品種提供分子水平上的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用的茶樹材料為河南省信陽茶葉示范園區信陽群體種。選取健壯茶樹的新梢幼葉，提取總RNA并反轉錄得到cDNA模板，利用RT－PCR技術克隆CsGPX基因片段。

選取長勢一致的茶樹健壯植株枝條，于人工氣候箱內進行Hoagland完全營養液水培，每3 d更換1次營養液，1周后進行干旱處理。用滲透勢為－1.0 MPa的聚乙二醇6000模擬干旱脅迫進行培養，分別收集脅迫 0、3、6、9、12、18、24 h的茶樹幼葉，液氮冷凍后保存，分別提取總RNA并反轉錄得到不同的cDNA模板，利用real－time PCR技術檢測CsGPX基因轉錄表達量。

1.2 試驗試劑

DNA分子量標準、Taq DNA聚合酶、dNTPs、克隆載體pMD18－T、DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex Taq，購自TaKaRa公司；在Primer Premier 5.0中進行引物設計；引物合成及測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 引物序列

CsGPX基因克隆引物為F1：5′－GTCAATGTTGCCTCACA ATGTGG－3′，R1：5′－CAGCTTCTTCACGTCCTTCTCAAT－3′。茶樹β－Actin基因real－time PCR引物為 F2：5′－AGGGTAT GCTCCTCCTCAT－3′，R2：5′－TCAGCAGTGGTGGTGAACAT－3′。CsGPX基因 real－time PCR引物為 F3：5′－GAGCCAGGG AATAATGAGC－3′，R3：5′－ATTGGAGCAGCATTCTCAC－3′。

1.4 CsGPX基因片段的信息學分析

分別利用 DNAMAN 6.0、Clustal X 1.81及 MEGA 5.2對CsGPX基因片段進行氨基酸序列推斷、保守序列分析、進化樹構建。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsGPX基因片段的克隆

根據其他物種GPX基因的保守序列設計特異擴增引物F1和R1，利用Trizol試劑提取茶樹幼葉總RNA，檢測RNA的質量后，進行反轉錄獲得cDNA第1鏈，以此為模板，經PCR擴增獲得1條大小約為400 bp的目的片段（圖1）。反應程序為94℃預變性5min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，32個循環；72℃延伸10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化，連接于克隆載體pMD18－T上，熱激轉化大腸桿菌DH5α。菌落PCR擴增鑒定后，挑取陽性克隆進行測序，經測序克隆到的基因片段長387 bp，利用DNAMAN 6.0軟件推斷其編碼129個氨基酸（圖2）。

2.2 茶樹CsGPX基因片段的生物信息學分析

從GenBank和PeroxiBase數據庫中下載擬南芥（AtGPX 1～AtGPX 8）、楊樹（PtGPX 1、2、5、8，PtGPX 6－1、PtGPX6－2）、水稻 （OsGPX1）、玉米 （ZmGPX1）、番茄 （SlGPX）、小 麥（TaGPX）等蛋白質的氨基酸序列，利用 DNAMAN 6.0和Clustal X 1.81軟件，與推斷的CsGPX基因片段編碼的氨基酸序列進行同源性比對。由圖3可知，CsGPX編碼的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列，即具有3個保守結構域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）以及酶活性中心的3個保守的半胱氨酸（C）殘基。初步推斷其克隆的基因序列是茶樹CsGPX基因片段。

利用 MEGA 5.2軟件，按 Neighbor－Joining方案對CsGPX及部分植物GPX蛋白的氨基酸序列進行分子系統進化分析，由圖4可知，CsGPX保守序列區域與擬南芥AtGPX6、楊樹PtGPX6－1、楊樹PtGPX6－2等親緣關系較近。

2.3 CsGPX基因在干旱脅迫下的轉錄表達分析

使用ABI7300熒光定量PCR儀進行表達量分析，采用20μL反應體系：10μL SYBR Premix Ex Taq，正、反向引物（10μmol／L）各0.5μL，0.4μL ROX Reference Dye（50×），2.0μL cDNA模板，6.6μL ddH2O。反應程序為95℃預變性90 s；PCR反應：95℃ 15 s，60℃ 40 s，共40個循環，每個樣品進行3次重復檢測，使用2－ΔΔCT法求得待測樣品的相對表達量。分別提取干旱脅迫處理 0、3、6、9、12、18、24 h茶樹幼葉的RNA，反轉錄為 cDNA，以此為模板，利用 Primer Premier 5.0設計茶樹β－Actin定量PCR引物為F2、R2，CsGPX基因定量PCR引物為F3、R3，以茶樹β－Actin片段為內參，檢測CsGPX在干旱脅迫下的轉錄表達量變化。由圖5可知，隨著干旱脅迫處理時間的延長，相對表達量呈現先升后降的變化趨勢，在處理12 h時，CsGPX轉錄相對表達量達到最大值，約是對照的6倍。隨后又降低，24 h后逐漸恢復至處理前的水平。

3 結論與討論

本研究中克隆茶樹CsGPX基因片段所編碼的氨基酸序列具有植物GPX的3個特征保守結構域，且含有GPX活性中心的3個保守的半胱氨酸殘基，因此，所克隆的CsGPX基因屬于植物GPX家族成員。且與已報道的AtGPX6、PtGPX6、TaGPX等親緣關系較近。初步研究CsGPX的轉錄表達受干旱脅迫誘導，表明CsGPX參與茶樹抗旱信號轉導途徑。已報道AtGPX6定位于線粒體和胞質，在多種組織的整個發育過程中都高度表達［3］，鹽、鐵、鋁脅迫增強了AtGPX6的mRNA表達水平［6］。利用水楊酸（SA）、生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）等處理后，也引起AtGPX6轉錄表達量的增加［3］。在AtGPX6基因的啟動子區含有ABA、SA、IAA響應元件。另外，定位于小麥葉綠體中的TaGPX基因轉入擬南芥超表達后，表現出對鹽、H2O2、ABA脅迫的強耐性，且鹽、H2O2、ABA信號轉導通路中的關鍵調節子基因（SOS1、RbohD、ABI1／ABI2）的表達水平也在轉基因株系中改變［7］。干旱脅迫下水稻的GPX酶活性也增強［8］。這些植物GPX的功能研究為CsGPX的深入研究提供了參考。將來對CsGPX基因的全長進行克隆，將其原核表達，檢測其亞細胞定位。也將進一步研究CsGPX酶活性在干旱脅迫中的變化以及其作用底物的特異性，為闡明CsGPX在干旱脅迫信號轉導中的作用機制奠定基礎。

參考文獻：

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［5］肖 蓉，羅慧珍，張小娟，等.干旱和鹽脅迫條件下棗樹谷胱甘肽過氧化物酶基因（ZjGPX）的差異表達及功能分析［J］.中國農業科學，2015，48（14）：2806－2817.

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