無油樟與葡萄、擬南芥、水稻基因組的多倍化及共線性分析

張 嵐，袁 敏，王振怡，潘玉欣

（華北理工大學生命科學學院／華北理工大學基因組學與計算生物學研究中心，河北唐山063210）

全基因組加倍，又稱伴隨基因丟失的多倍化，長期以來已經成為動物、真菌和其他生物，尤其是植物基因組進化的一個重要驅動力［1］。隨著全基因組加倍的進行，基因組結構常常會發生明顯改變，如染色體重組、基因倒位、基因丟失等，而多倍化產生的大量重復基因成為遺傳創新的重要材料來源［2］。被子植物是迄今為止陸地植物的最大族群，有超過300 000種生物，大多數開花植物的進化過程均受到多倍化影響［3］。研究表明，在被子植物的早期進化過程中甚至存在古多倍化事件。無油樟是縱觀被子植物歷史的一個重要的參照，是已測序的開花植物中最古老的物種之一，基因組結構和種系基因組學分析表明，被子植物的祖先是多倍體，祖先基因在被子植物生物學中起著關鍵作用［4－6］。雙子葉植物的共同祖先有7條染色體，在13 000萬年前經歷了雙子葉植物共有的三倍乘（γ）事件后，又經歷染色體的融合等過程，葡萄基因組形成現有的19條染色體［7－8］。作為首先被測序完成的開花植物，擬南芥在和葡萄一樣經歷了雙子葉植物共同祖先的三倍乘（γ）事件后，又發生了最近的 2次二倍乘（α，β）事件［9－12］。水稻是單子葉禾本科植物中重要的模式植物，基因組拼接較為完整，其結構也最接近禾本科植物基因組。水稻基因組在約1億年前經歷了禾本科植物共有的全基因組加倍事件，而后又先后發生了2次自己獨立的全基因組二倍乘事件［13－14］。這些多倍化產生的重復基因為大范圍分析基因進化和功能提供了有價值的參考。

本研究對無油樟、葡萄、擬南芥、水稻基因組進行比較基因組學分析，通過4個物種基因組內和基因組間的同源共線性分析，明確多倍化過程對重復基因造成的影響，解析基因組在進化過程中發生的變化，對于探尋單、雙子葉植物的共同起源以及研究被子植物的進化過程具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 全基因組序列數據

葡萄（Vitis vinifera，簡稱 Vv）的全基因組序列來自Phytozome（https：／／phytozome.jgi.doe.gov），無油樟（Amborella trichopoda，簡稱 Ar）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，簡稱 At）和水稻（Oryza sativa，簡稱 Os）的全基因組數據來自 PGDD（http：／／chibba.agtec.uga.edu／duplication）。其中，無油樟基因組涉及1 210個scaffolds，26 846個基因；葡萄有19條染色體，26 346個基因；擬南芥有5條染色體，27 416個基因；水稻有12條染色體，39 049個基因。

1.2 全基因組同源結構分析

為了更準確地尋找各物種基因組內以及基因組間的同源結構片段，本研究對獲取的原始基因組數據進行了數據預處理。對于無油樟，選取前100個長度2 Mb以上的scaffolds，其他物種均去除沒有錨定到染色體上的基因。利用基本局部序列比對工具 BLASTP（E≤10－5）［15］，對單一物種基因組內以及2個物種基因組間作雙序列比對，獲取基因組內以及基因組間的同源基因對。

結合基因組內及基因組間雙序列比對結果與各個物種染色體的長度信息、染色體上各個基因的位置信息，編寫Perl程序繪制同源結構點陣圖，并且標記出基因對間匹配最好、次好以及其余的3個基因對。根據同源結構點陣圖上基因對組成的成線性的片段，驗證各個物種在進化歷程中發生的全基因組加倍事件，同時為共線性數據分析提供圖示化依據。

1.3 全基因組共線性分析

利用共線性分析工具 MCScan［16］和 Colinearscan（P＜0.05）［14］，獲取基因組內以及基因組間同源共線區域。為了描述同源共線片段的相似性，在基因組內和基因組間，考慮到大的基因家族（重復基因對數≤30個）［17］以及串聯重復基因（基因對間相對位置 ＜2×106bp）［18］的影響，按照同源共線區域內包含的基因對數量，統計在不同長度范圍的同源共線區域的數量和區域內包含的同源共線基因對數量、無油樟與其他物種基因組間共線性基因的保留情況，以及無油樟與擬南芥、葡萄、水稻基因組間共有的無油樟基因占共線性基因的百分比。

1.4 多物種基因組聯合比對圖譜的構建

本研究以葡萄基因組三倍乘事件的共線性基因作為參考列，結合基因組內和基因組間同源共線性分析結果，建立多物種基因組聯合比對列表，并編寫python程序，利用Matplotlib繪制多物種基因組聯合比對圖譜，以圈圖的形式反映基因組間的相似性。

2 結果與分析

2.1 基因組內及基因組間同源結構分析

以1個已知的較為古老的物種或者全基因組發生加倍次數較多的物種基因組內的同源結構點陣圖為依據，結合2個物種基因組間的同源結構點陣圖，可以基本推斷后一物種在進化過程中在全基因組層面發生的主要加倍事件，而且能夠統計出在不同加倍事件中參與的基因數量。

在同源結構點陣圖中，紅色的點表示在物種基因組間進行的蛋白質序列比對中，處于最佳匹配的同源基因對，表示物種間的直系同源片段；藍色的點表示的是次好匹配的同源基因對，而灰色的點表示的是其余的同源基因對，均表示種間旁系同源片斷。

無油樟是被子植物中已測序的最古老的物種，其基因組沒有被錨定到某一條染色體上，從無油樟基因組內的同源結構點陣圖中，看到的是一些非常短小的線段，很難分析出其自身的加倍過程。而在無油樟和葡萄2個物種基因組間的同源結構分析中，發現無油樟的9號scaffold與葡萄的2、5、16號染色體之間存在1∶3同源共線關系，無油樟的29號scaffold與葡萄的6、8、13號染色體之間存在的1∶3同源共線關系。在無油樟的第12、40號scaffold與葡萄的6、8、13號染色體之間，以及第49號scaffold與葡萄的第1、14、17號染色體間也存在明顯的1∶3的同源共線關系。同樣，在其他scaffold與葡萄染色體之間也存在類似情況（圖1）。這與 Amborella Genome Project報道的結果［4］相符。

2.2 同源共線片段推斷

本研究使用共線性分析工具推測無油樟與葡萄、擬南芥、水稻基因組內和基因組間的同源共線片段。結果表明，同源性往往依賴于長的同源共線性片段，而不同基因組間的高相似性對解析基因組結構、功能與基因家族的分析提供了幫助［18］。

在無油樟基因組內，存在102個長度≥4個基因對的同源共線區域，包含473個基因對，這說明其同源共線性較差。同樣，在同源結構點陣圖中也看不到大段的連續區域。當同源共線區域≥20個基因對長度時，葡萄基因組內部包含21個同源共線區域，595個同源共線基因對，最長的片段位于葡萄的5號和7號染色體之間，包含52個基因對；擬南芥基因組內部包含52個同源共線區域，有2 472個同源共線基因對，最長的片段位于擬南芥的3號和2號染色體之間，包含181個基因對；水稻基因組內包含34個同源共線區域，共2 774個同源共線基因對，最長的片段位于水稻的1號和5號染色體之間，包含250個基因對。而在水稻基因組內，在不同的基因對長度范圍，得到的同源共線性區域以及同源共線性基因對的數量相對較多，超過200個基因對長度的區域有2個，包含499個同源基因對。大量的長片段存在于水稻和擬南芥基因組內（表1），這與同源結構點陣圖得到的結論相符。研究表明，無油樟與其他幾個物種相比，擁有最短的共線性同源區域，它是最古老的物種，在漫長的歷史進程中，基因組的結構遭受了嚴重的破壞，而其他幾種模式植物則相對保存了較好的同源共線性。

在無油樟基因組與其他物種的共線性分析中，發現在不同長度同源共線區域限定時，無油樟與葡萄的基因組間保存相對較好的同源共線區域及同源共線基因對數量。當同源共線區域≥10個基因對長度時，在無油樟與葡萄基因組間有139個同源共線區塊，包含2 311個基因對；無油樟與擬南芥基因組間包含14個同源共線區塊，包含164個基因對；在無油樟與水稻基因組間包含49個同源共線區塊，包含622個基因對。當同源共線區域≥20個基因對長度時，在無油樟與葡萄基因組間有33個共線性區塊，包含928個基因對，最長的片段位于無油樟的第2號scaffold和葡萄的第5號染色體之間，包含52個基因對；在無油樟和水稻基因組間包含2個共線性區塊，包含42個基因對，最長的片段位于無油樟的第25號scaffold和水稻的第2號染色體之間，包含22個基因對；無油樟和擬南芥基因組間沒有發現超過20個同源共線基因對的同源共線區域。在無油樟與葡萄間甚至存在2個超過50個基因對長度的區域，共有102個同源共線基因對（表1）。研究發現，以只經歷了古老的被子植物全基因組加倍事件的無油樟基因組為參考，水稻和擬南芥基因組在進化歷程中經歷的加倍事件相對葡萄基因組復雜，二者所保留的同源共線區域和同源共線基因對數比葡萄基因組少。

2.3 同源共線性基因的保留情況分析

本研究涉及的4個物種在經歷了各自的加倍事件后，其基因組不可避免地發生了分離、融合現象，從而導致各物種的基因存在不同程度的丟失，其中葡萄基因組丟失得最少（49.1%），水稻的次之（62.1%），擬南芥丟失得最為嚴重（652%）。這可能是由于葡萄有19條染色體，其基因組保留了大量的祖先基因，基因組比較穩定。在葡萄、擬南芥、水稻3個物種之間，擬南芥和葡萄間保留的同源共線性基因比例達到了40.8%，而水稻和葡萄、水稻和擬南芥之間保留的同源共線性基因則相對較少，顯然這與被子植物單、雙子葉間的親緣關系相關，親緣關系越近，同源共線性基因丟失得越少（表2）。

表1 無油樟（Sca1～Sca100）與其他物種基因組內與基因組間同源共線性區域以及基因對數量統計結果

表2 無油樟、葡萄、擬南芥和水稻基因組間同源共線性基因保留情況統計結果

本研究統計了無油樟和擬南芥與無油樟和水稻、無油樟和擬南芥與無油樟和葡萄、無油樟和葡萄與無油樟和水稻保留的無油樟的基因數。發現無油樟和葡萄與無油樟和水稻間保留的無油樟基因數最多（30.6%），無油樟和擬南芥與無油樟和水稻間保留的無油樟的基因數最少（26.7%），詳見表3，這說明被子植物的祖先基因在進化過程中發生了大規模丟失，可能是由于物種各自的加倍事件造成的。

2.4 多物種基因組聯合比對圖譜的構建

作為雙子葉植物中重要的模式植物，葡萄基因組保存了雙子葉植物最完整的γ事件，在13 000萬年前經歷了雙子葉植物共同祖先的全基因組三倍乘（γ）事件，而后并未發生單獨的多倍化事件，因此以葡萄為參考，基于物種基因組內和基因組間的同源共線性分析結果，構建多物種基因組聯合比對圖譜。

表3 無油樟與葡萄、擬南芥、水稻基因組間保留的Amborella同源共線基因保留情況統計結果

由于葡萄和擬南芥共同經歷了雙子葉植物共同祖先的三倍乘事件，而擬南芥又先后發生了自己的2次二倍乘事件，因此，圖2中的3圈葡萄分別對應3組擬南芥，而每組擬南芥又分別對應自己的2次二倍乘事件。由圖2還可以看出，由內往外圈顏色分布越來越淡，這說明物種間的直系同源關系在進化過程中保持了相對完整，而物種內的旁系同源基因對則發生了大規模的丟失。由于無油樟與葡萄間存在1∶3的共線性關系，因此對應有1圈無油樟，可以看出圖2在此圈有大量空白，說明存在大量基因片段的缺失。在多物種基因組聯合比對圖譜中，可以根據不同顏色來判定同源基因在物種間的分布情況，還可以用于分析各物種染色體的重組現象，其中每條染色體上不同的顏色區域都預示可能的染色體重組現象。圖譜直觀地闡釋了各個物種基因組在進化過程中發生的基因丟失情況，同時也反映各物種染色體的結構變化。物種基因組的加倍規模和次數對基因組的影響在圖譜中清晰可見，重復基因越多，可能造成基因組的不穩定以及基因丟失的增多。

3 討論與結論

多倍化是被子植物進化史上的重要特征，全基因組加倍對基因組結構及基因家族的進化有重要的影響［19］。本研究對無油樟、葡萄、擬南芥和水稻基因組進行了比較基因組學分析，在同源基因點陣圖中發現無油樟基因組內的同源性較差，而在無油樟與其他幾個物種的點陣圖中也得到類似結果。而由無油樟與葡萄的點陣圖得到與已有報道相同的結果，結構分析表明，無油樟和葡萄基因組之間存在很明顯的1∶3的關系，這與古多倍體的γ事件相契合，表明無油樟發生的全基因組加倍不是特殊的譜系事件，可能是發生在2個物種的共同祖先中的，由此推斷無油樟的分化要早于古γ事件。這可能是受無油樟基因組測序質量的影響，并與無油樟是已測序的最古老的開花植物有關［4］。

本研究在推測同源共線片段時，采用了嚴格的閾值限制，包括合適的E值、P值、刪除可能的大的重復基因家族和串聯重復基因，同時區分同源共線片段的大小，從而保證了研究結果的可靠性［17－18，20］。本研究結果表明，在與無油樟的比較分析中，擬南芥和水稻同源共線性區域以及基因對數都比葡萄少，葡萄基因組所擁有的大片段數也是最多的，這說明物種基因組的加倍次數越多，加倍情況越復雜，所擁有的同源共線區域以及基因對數就越少，擁有的祖先基因也就越少。同時，在2個物種基因組間雙向BLASTp得到的最佳匹配基因在共線基因的保留情況統計結果中［19］，發現葡萄基因組所保留的基因數最多（50.9%），無油樟與擬南芥、水稻間丟失的無油樟的基因數最多（73.3%），無油樟與葡萄、水稻間丟失的無油樟的基因數最少（69.4%），整體來說，保留的無油樟基因數在1／3左右。本研究結果表明，在經歷了物種基因組各自共有和單獨加倍事件后，基因組的穩定性明顯降低，并伴隨著基因的丟失，而丟失仍將繼續，該過程大多存在隨機性。實際上，從多倍化的推斷、非正常重組的分析、基因家族的進化分析等，在很大程度上都依賴于共線性分析，可以說，物種基因組內和基因組間共線性分析是比較基因組研究最重要的內容之一，是解析基因組結構和功能、研究基因、基因家族，以及調控路徑等進化規律的重要契機，對基因組學許多研究工作都發揮著至關重要的作用。

參考文獻：

［1］Edger P P，Pires JC.Gene and genome duplications：the impact of dosagesensitivity on the fate of nuclear genes［J］.Chromosome Research，2009，17（5）：699－717.

［2］Otto S P.The evolutionary consequences of polyploidy［J］.Cell，2007，131（3）：452－462.

［3］Lyons E，Pedersen B，Kane J，et al.Finding and comparing syntenic regions among Arabidopsis and the outgroups papaya，poplar，and grape：CoGewith rosids［J］.Plant Physiology，2008，148（4）：1772－1781.

［4］Amborella Genome Project.The Amborella genome and the evolution of flowering plants［J］.Science，2013，342（6165）：1241089.

［5］Chamala S，Chanderbali A S，Der JP，et al.Assembly and validation of the genome of the nonmodel basal angiosperm Amborella［J］.Science，2013，342（6165）：1516－1517.

［6］Rice DW，Alverson A J，Richardson A O，etal.Horizontal transfer of entire genomes via mitochondrial fusion in the angiosperm Amborella［J］.Science，2013，342（6165）：1468－1473.

［7］Tang H B，Bowers JE，Wang X Y，et al.Synteny and collinearity in plant genomes［J］.Science，2008，320（5875）：486－488.

［8］Jaillon O，Aury JM，Noel B，et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla［J］.Nature，2007，449（7161）：463－467.

［9］Vision T J，Brown D G，Tanksley S D.The origins of genomic duplications in Arabidopsis［J］.Science，2000，290（5499）：2114－2117.

［10］Barker M S，Vogel H，Schranz M E.Paleopolyploidy in the Brassicales：analyses of the cleome transcriptome elucidate the history of genome duplications in Arabidopsis and other Brassicales［J］.Genome Biology and Evolution，2009，1（1）：391－399.

［11］Jiao Y N，Leebens－Mack J，Ayyampalayam S，et al.A genome triplication associated with early diversification of the core eudicots［J］.Genome Biol，2012，13（1）：R3.

［12］Kaul S，Koo H L，Jenkins J，Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana［J］.Nature，2000，408（6814）：796－815.

［13］Wang X Y，ShiX L，Hao B L，etal.Duplication and DNA segmental loss in the rice genome：implications for diploidization［J］.New Phytologist，2005，165（3）：937－946.

［14］Wang X Y，Shi X L，Li Z，et al.Statistical inference of chromosomal homology based on gene colinearity and applications to Arabidopsis and rice［J］.BMC Bioinformatics，2006，7（1）：447－459.

［15］Altschul S F，Gish W，Miller W，et al.Basic local alignment search tool［J］.Journal of Molecular Biology，1990，215（3）：403－410.

［16］Tang H B，Wang X Y，Bowers J E，et al.Unraveling ancient hexaploidy through multiply－aligned angioserm gene maps［J］.Genome Research，2008，18（12）：1944－1954.

［17］Wang X Y，Wang JP，Jin D C，et al.Genome alignment spanning major Poaceae lineages reveals heterogeneous evolutionary rates and alters inferred dates for key evolutionary events［J］.Molecular Plant，2015，8（6）：885－898.

［18］Wang JP，Yu JX，Sun PC，et al.Comparative genomics analysis of rice and pineapple contributes tounderstand the chromosome number reduction and genomic changes in grasses［J］.Frontiers in Genetics，2016，7：174.

［19］Jiao Y N，Wickett N J，Ayyampalayam S，et al.Ancestral polyploidy in seed plants and angiosperms［J］.Nature，2011，473（7345）：97－100.

［20］Wang X Y，Tang H B，Paterson A H.Seventy million years of concerted evolution of a homoeologous chromosome pair，in parallel，in major Poaceae lineages［J］.Plant Cell，2011，23（1）：27－37.