白睡蓮黑斑病菌的生物學特性及室內防治藥劑篩選

朱潔倩，魏 蜜，張 偉，劉 月，傅本重，李國元

（1.湖北工程學院生命科學技術學院／特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北孝感432000；2.湖北大學生命科學學院，湖北武漢430062）

白睡蓮（Nymphaea alba）為多年生水生草本，是一類具有很高觀賞價值的園林花卉。原產埃及尼羅河，國內各省區均有栽培［1］。它不僅是水景園中必備的浮葉性水生花卉，也是優良的新型切花，且根狀莖既可食用或釀酒又可入藥，能治小兒慢驚風，全草也可以作綠肥［2］。

白睡蓮病害主要包括睡蓮腐爛病、黑根病、褐紋病、葉腐病、斑腐病和炭疽病等［3－4］。2015年8—10月，筆者在湖北省孝感市農業科學院試驗園發現白睡蓮黑斑病發病率達80%，從黑斑病病葉上分離獲得1株真菌SL－1512，對其完成致病性測定，依據病原菌形態特征結合rDNA－ITS序列分析，將其鑒定為草莖點霉菌（Phoma herbarum）；為明確該病原菌的生物學特性和最佳的室內抑菌藥劑，對不同條件下病原菌菌絲的生長情況展開分析和室內藥劑平板篩選，以確定該菌株的生物學特性，為進一步的田間防效試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患黑斑病的白睡蓮葉片采自湖北省孝感市農業科學院試驗基地。

本試驗選取以下6種培養基作為供試培養基：馬鈴薯蔗糖培養基（PSA）、馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、查氏培養基（CA）、清水洋菜培養基（WA）、燕麥培養基（OA）和玉米粉培養基（CMM），其配制方法參照《植病研究方法》［5］。

篩選和分離白睡蓮黑斑病病菌采用PSA培養基，藥劑篩選試驗用的3種生產上常用農藥詳細情況見表1［6－7］。

蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 供試藥劑及試驗濃度

1.2 白睡蓮黑斑病病菌的生物學特性研究

參照傅本重等報道的生物學特性研究方法［8］，共選取以下8個指標對該致病菌進行生物學特性分析，包括最佳培養基、碳源、氮源、溫度、pH值、致死溫度、最佳光照和通氣條件，每個處理5皿，試驗重復2次。

各指標研究中，接種方法均是沿PSA培養基上培養7 d的病原菌菌落邊緣打取菌齡一致的菌餅（直徑6 mm）置于培養基平面中間，置于28℃霉菌培養箱培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 室內藥劑平板篩選

按照試驗設計，加入一定量的藥劑至凝固前的PSA培養基中混合均勻倒入培養皿中，配成相應濃度的含殺菌劑的平板，以不加殺菌劑的PSA為對照，每個濃度重復5皿，試驗重復3次。接種觀察和分析方法同“1.2”節。根據測得的菌落直徑，利用數據分析軟件，計算出各濃度下的相對抑菌率［9］，取濃度對數值為x，相對抑菌率幾率值為y［10］，作出毒力回歸方程［11］，并計算4種供試藥劑對病原菌的有效中濃度（EC50）。

菌落凈直徑＝菌落直徑－菌餅直徑（6 mm）；

1.4 數據分析

采用數據處理軟件Excel 2010、SPSS 22和Origin 8對試驗數據進行統計學分析，得出毒力回歸方程、決定系數，然后根據毒力回歸方程計算有效中濃度（EC50），作圖、進行顯著性差異分析（α＝0.05）。

2 結果與分析

2.1 草莖點霉菌最佳培養基配方篩選

草莖點霉菌在不同培養基上菌落的生長情況如表2所示。結果表明，該草莖點霉菌在供試的6種培養基上均能生長，但生長速率及菌絲密集程度存在明顯差異。無論是從生長速率，還是菌絲密集程度來看，PDA和PSA均有利于該草莖點霉菌的生長，生長速率分別達9.61、9.53 mm／d；其次有利于病原菌生長的是OA，生長速率為7.60 mm／d；而在WA上生長速率最為緩慢，其直徑雖然達到30.1 mm，但是菌絲很稀疏，僅有很薄的1層。

表2 草莖點霉菌絲在不同培養基上的生長情況

2.2 草莖點霉菌最佳碳源篩選

草莖點霉菌在不同碳源培養基上菌落生長情況如表3所示，試驗結果表明，多種不同的碳源都能被草莖點霉菌利用，但不同碳源對草莖點霉病原菌的生長影響較大。當葡萄糖作為碳源時草莖點霉菌生長速率最快，這可能與速效碳源更容易利用有關；其次是淀粉、蔗糖和果糖，而在無碳源條件下生長最緩慢且菌絲最稀疏，僅有很薄的1層。

表3 草莖點霉菌絲在不同碳源培養基上的生長狀況

2.3 草莖點霉菌最佳氮源篩選

草莖點霉菌在不同氮源培養基上菌落生長情況如表4所示，草莖點霉菌絲在以蛋白胨為氮源的培養基上菌落最大且生長速率最快，在以硝酸鈉和尿素為氮源的條件下次之，在硝酸銨和無氮源條件下較差，說明這幾種氮源里蛋白胨為最優氮源。這一結果與西藏青稞病害病原菌的最優氮源［12］類似，但與吉祥草葉斑病病菌細極鏈格孢的最優氮源結果［13］不一致，這說明不同真菌的最佳氮源存在較大差異。

表4 草莖點霉菌絲在不同氮源培養基上的生長狀況

2.4 草莖點霉菌最佳溫度篩選

溫度對草莖點霉菌生長的影響如圖1所示。結果表明，28℃為草莖點霉菌的最適生長溫度，此時菌落直徑最大，生長狀況最佳，且該病原菌在試驗溫度5～28℃范圍內均可生長。在5℃條件下，生長速率非常緩慢，而在37、42℃條件下均不能生長。該結果與張麗等的研究結果［14］一致，高溫不利于草莖點霉菌生長。

2.5 草莖點霉菌最佳pH值篩選

在pH值為4～10條件下，草莖點霉菌的外觀形態各指標均無明顯區別，無論是菌絲生長速率，還是菌落的顏色、稀疏程度，均沒有明顯差異，表明草莖點霉耐受pH值范圍廣。由圖2可知，pH值6.0為最適pH值，此時菌落直徑最大，生長速率達到9.96 mm／d，其次是pH值為5.0和 pH值為7.0的條件，而在pH值為10.0下生長稍慢，生長速率為8.41 mm／d。

2.6 草莖點霉菌致死溫度研究

結果表明，草莖點霉在經40、45、50℃水浴處理后，菌絲仍然能生長，但是生長緩慢，而在55℃水浴處理后，菌絲不能生長。由此可見，草莖點霉菌致死溫度為55℃，該草莖點霉不能耐高溫。

2.7 草莖點霉菌的最佳光照和通氣條件

試驗結果表明，光暗變化對草莖點霉菌生長的影響不顯著。在光照為0、8、12、16、24 h條件下草莖點霉菌菌絲生長均良好，其中生長速率最大的是在8 h—16 h（光—暗）條件下，達10.74 mm／d。通氣與不通氣條件下菌絲生長速率差異不顯著，分別為 9.11、8.87 mm／d。

2.8 不同藥劑對病原菌的抑菌效果

以不加殺菌劑的PSA為對照，選用3種常見殺菌劑對草莖點霉菌進行室內抑菌率測定，試驗結果（表5）表明，3種殺菌劑對草莖點霉菌的生長都產生了一定影響。其中80%代森錳鋅效果最好，加了該殺菌劑的平板其菌絲直徑明顯小于對照平板。在推薦濃度（藥劑包裝上推薦的最低使用濃度）1 000 mg／L下及培養基內含藥濃度為1 000 mg／L時，菌絲基本無法生長，其相對抑菌率達97.1%，在此基礎上再稀釋5倍即降低濃度至200 mg／L后，抑菌率仍然高達92.5%，EC50為1.2mg／L。其次是47%春雷·王銅，在培養基內含47%春雷·王銅1 000 mg／L時，相對抑菌率達到61.5%，但是當濃度降至200 mg／L后，其抑菌率大幅度降低，僅為2.6%，EC50為811.4 mg／L。3種供試藥物中80%烯酰嗎啉對病原菌抑菌效果最差，同樣在推薦濃度250 mg／L下，相對抑菌率僅為31.5%，在此基礎上再稀釋5倍后，抑菌率降至 22.4%，其EC50達 1 418.6 mg／L。

表5 不同殺菌劑對病原菌的毒力

3 結論與討論

本試驗對白睡蓮黑斑病病原菌的生物學特性進行了研究，其最適生長培養基為PDA和PSA，碳源和氮源分別以葡萄糖和蛋白胨最有利于病原菌生長，28℃為草莖點霉菌的最適生長溫度，在低于5℃和高于37℃條件下都不利于菌絲生長，與牛曉慶等的研究結果［15］基本一致。該草莖點霉菌對pH值不敏感，在4～10范圍內均能生長，菌絲生長最適pH值為6。

研究表明，草莖點霉能引起鴨跖草葉斑病［16］、甘草斑點?。?7］，還能引起青棗的腐敗變質［18］，是一種分布廣泛的植物病原真菌，并且具有降解植物的特性，同時也能利用其自身植物毒素，開發生物源除草劑發揮除草作用。為了降低化學除草劑對環境的污染問題，可以將草莖點霉菌與低劑量的化學除草劑復配使用，這樣化學除草劑也能彌補除草真菌的不足，使之更高效［19］。

室內防治藥劑篩選試驗結果表明，在推薦使用質量濃度下，80%代森錳鋅對病原菌菌絲生長的抑制效果最好，相對抑菌率達97.1%，以80%烯酰嗎啉對病原菌的抑制效果最差，相對抑菌率僅為31.5%。陳旭玉等對廣藿香棒孢霉葉斑病病原菌藥劑篩選結果同樣表明80%代森錳鋅抑菌效果最好［20］，但是在傅本重等對吉祥草葉斑病菌室內防治藥劑篩選試驗中表明80%代森錳鋅抑菌效果較差［13］。這些研究表明，同一藥劑對不同病原菌的抑制效果差異較大，在室內或實際應用中應針對不同的病原菌種類，施用不同濃度的不同藥劑。室內藥劑篩選結果是依據離體條件下殺菌劑對睡蓮黑斑病病原菌的抑菌效果分析得到的，其田間應用效果還不確定，因此，研究結果具有一定的局限性，可借鑒本研究結論進一步進行田間防效試驗及評價。

參考文獻：

［1］Aa H A V D.A leaf spot disease of Nymphaea alba in the Netherlands［J］.Netherlands Journal of Plant Pathology，1978，84（3）：109－115.

［2］柏斌斌，駱菁菁，李 虹，等.睡蓮品種數量分類的初步研究［J］.北方園藝，2011（22）：75－78.

［3］黃子鋒，王鳳蘭，王燕君.睡蓮主要病害及防治［J］.現代化農業，2005（11）：6－7.

［4］吳德水.白蓮主要病害及其防治［J］.植保技術與推廣，1995（6）：24－25.

［5］方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業出版社，1998：10－62.

［6］劉 霞，楊克強，朱玉鳳，等.8種殺菌劑對核桃炭疽病病原菌膠孢炭疽菌的室內毒力［J］.農藥學學報，2013，15（4）：412－420.

［7］徐 波，曾宋君，宋鳳鳴，等.兜蘭莖腐病病原鑒定和生物學特性及室內藥劑篩選研究［J］.廣東農業科學，2014，41（14）：70－75.

［8］傅本重，楊 敏，李國元，等.滇楸葉斑病病原菌的生物學特性及其抑菌藥劑篩選［J］.華中農業大學學報（自然科學版），2013，32（6）：65－69.

［9］Gorgolous S G.Detection and measurement of fungicide resistance general principles［J］.FAO Plant Prot Bull，1982，30（2）：39－71.

［10］張文梅，黃 河，蔣軍喜，等.10種殺菌劑對柑桔黑斑病菌的室內毒力測定［J］.中國南方果樹，2011，40（1）；28－29.

［11］明道緒.田間試驗與統計分析［M］.北京：科學出版社，2008：158－165.

［12］龔弘強，黃麗麗，喬宏萍，等.西藏青稞籽粒燕麥鐮刀菌生物學特性研究［J］.干旱地區農業研究，2007，25（2）：21－25.

［13］傅本重，趙文麗，王立華，等.吉祥草葉斑病菌的生物學特性及室內防治藥劑篩選［J］.西南農業學報，2015，28（1）：212－216.

［14］張 麗，潘龍其，王生榮，等.苜蓿莖點霉葉斑病病原鑒定及生物學特性研究［J］.中國農業大學學報，2015，20（4）：158－166.

［15］牛曉慶，唐慶華，余鳳玉，等.油棕葉斑病的病原鑒定及其生物學特性［J］.江西農業學報，2011，23（11）：103－105.

［16］紀明山，劉 欣，高云云，等.草莖點霉毒素Ⅲ衍生物的合成與除草活性［J］.農藥學學報，2015，17（5）：520－529.

［17］黃素芳，向本春，任毓忠，等.新疆甘草斑點病病原分離鑒定［J］.新疆農業科學，2009，46（3）：536－539.

［18］趙丹丹，王 云，付曉萍，等.臺灣青棗致腐微生物的分離鑒定及其抑制研究［J］.西南農業學報，2016，29（2）：379－384.

［19］紀明山，李思嘉，谷祖敏，等.草莖點霉毒素分離及除草活性研究［J］.中國農學通報，2013（24）：193－196.

［20］陳旭玉，何其光，甘炳春.廣藿香棒孢霉葉斑病拮抗菌的分離鑒定及生物農藥的篩選［J］.江西農業學報，2012，24（6）：64－66.