水楊酸濃度對膜莢黃芪生物量、總黃酮和多糖積累的影響

王景然，王 萌，汪 洋，呂 爽，付 爽，劉 佳，吳松權

（延邊大學農學院，吉林延吉133002）

黃芪是傳統的補益類中草藥，是多年生草本藥用植物，分為膜莢黃芪和蒙古黃芪2個變種［1］。黃芪主產于我國北方地區，如東北、華北、西北和內蒙古。膜莢黃芪別稱東北黃芪，是長白山的道地藥材之一，是重點保護的珍惜藥用植物。黃芪中富含黃酮類、黃芪皂苷、多糖類等［2］多種化學成分，其化學成分決定藥用價值?，F代藥理學研究表明，黃芪具有提高機體免疫力、強心降壓、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理功效，能促進免疫器官功能和抗體生成［3］。黃芪不僅用于臨床治療，在保健、食品、化妝品等領域也得到廣泛的應用?，F今，市場對黃芪的需求主要運用在生產各類黃芪制劑和以黃芪為原料的保健品等方面，由于以黃芪為主的新藥研發不斷取得突破，導致野生資源遭到嚴重破壞［4］，只能通過人工栽培滿足市場需求，而人工栽培黃芪技術又不完善，存在明顯的缺陷，人工栽培的黃芪與野生黃芪在主要活性成分含量上存在一定的差距［5］。因此，如何提高黃芪活性成分的積累將在黃芪生產過程中有著十分重要的意義［6］。

水楊酸（salicylicacid，SA）是一種廣泛分布于高等植物體內的小分子酚類物質［7］，被認為是一種內源信號分子，對植物種子萌發、成花誘導、呼吸代謝、抗性及衰老等生理過程有重要調節作用。水楊酸可以通過改變多種細胞代謝和調節防御機制來響應各種生物和非生物脅迫，從而增強植物的抗逆性［8］。最近幾年，已經有大量的關于外源水楊酸在果樹、蔬菜、作物、草坪等方面抵御非生物脅迫的相關報道［7－8］。通過研究發現，水楊酸可以通過調節抗氧化酶系統響應逆境脅迫，提高POD、SOD等抗氧化酶的活性來保護細胞質膜通透性和降低MAD的含量，從而提高植物對干旱、高溫、高鹽等逆境脅迫的抗性。同時水楊酸處理可以提高植物植保素及其相關合成酶類、蛋白含量和各種防御機制，促進植物代謝產物的生成，從而提高植株的抗病性。適宜濃度的水楊酸處理促進植株根與葉的生長，調節植株的光周期和植株葉片氣孔，從而提高植物的光合速率和光合產物的積累［9］。

目前，關于黃芪的研究主要集中于主要化學成分的提取和藥理活性方面。由于植物的化學成分生物合成的復雜性，促使人們通過不同的手段誘導化學成分的積累。通過誘導子對目標代謝產物的生物合成途徑進行調控，被認為是能夠提高植物化學成分含量的重要方法之一［10］。水楊酸作為誘導子之一，有利于化學成分的積累。如Tewari等研究表明，水楊酸能夠誘導一氧化氮和ROS生成，刺激人參根中人參皂苷的積累［11］。而水楊酸應用于黃芪的研究鮮有報道。因此，本試驗旨在研究水楊酸對膜莢黃芪幼苗生長過程中總黃酮和多糖化學成分積累的影響，為提高膜莢黃芪活性成分的含量提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

長白山野生膜莢黃芪種子；蕓香苷對照品，購于上海融禾醫藥科技發展有限公司；DPPH，購于Solarbio公司；紫外可見分光光度計，購于屹譜儀器制造（上海）有限公司；其他試劑均為分析純，購于國內公司。

1.2 膜莢黃芪幼苗的培養與處理

2016年10月11日在實驗室參照Wu等的方法［12］，先用流水沖洗黃芪種子3 h，75%乙醇溶液浸泡1 min，無菌水沖洗3次，再用0.1%HgCl2消毒2 min，無菌水沖洗3次，將處理的膜莢黃芪種子平鋪于培養皿上，置于溫度為26℃的培養箱中暗培養。10月16日待到種子生根發芽長出子葉時，轉到光照為2 500 lx、光／暗為16 h／8 h、溫度為25℃的培養室中培養。11月11日選取生長旺盛、生長勢一致和伸出真葉的黃芪幼苗作為試驗材料進行水楊酸噴施處理，水楊酸濃度分別為 100、200、400μmol／L，分別培養 1、3、7 d收集幼苗，以噴施清水作為對照組，共12個處理，每個處理3次重復。在水楊酸噴施處理前先收集部分黃芪幼苗作為原始對照。

1.3 黃芪生物量的測定

從每個處理中選取生長勢一致的3株黃芪幼苗在60℃下烘干至恒質量，測量其干物質的質量，取平均數即為生物量，其他樣品烘干后用于測定總黃酮和多糖含量，所有樣品都設置3次重復。

1.4 黃芪總黃酮的提取與含量測定

1.4.1 黃芪總黃酮的提?。?3］稱取 0.1 g烘干至恒質量的樣品，加入液氮充分研磨，加入2 mL無水乙醇，175 r／min振蕩萃取 24 h，超聲處理20 min，12 000 r／min離心15 min，收集上清液用無水乙醇定容至2 mL，即為樣品溶液。

1.4.2 黃芪總黃酮含量的測定 采用硝酸鋁比色法［14］測定，具體的方法參照秦嘉澤等的方法［4］：準確稱取1 mg蕓香苷標準品，用30%乙醇溶液溶解定容到容量瓶中，混合均勻配置成標準溶液。分別準確量取對照品溶液0、0.4、0.8、12、1.6、2.0 mL置于容量瓶中，用 30%乙醇加至 5 mL，分別加入0.3 mL 5%亞硝酸鋁溶液，混合靜置7 min，加入0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液，混合靜置7 min，加入2.0 mL 1 mol／L的氫氧化鈉溶液，并用30%乙醇定容至10 mL，靜置16 min，測定其在510 nm波長處的吸光度。以標準溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線 y＝11.789 9x＋0.066 7，r2＝0.997 8。

取0.5 mL樣品溶液，空白對照組為取樣0 mL，參考標準曲線制備方法中的“用30%乙醇加至5 mL”起，至“測定樣品溶液的吸光度”，通過標準曲線方程，計算樣品溶液總黃酮的濃度。

1.5 黃芪多糖的提取與含量測定

1.5.1 黃芪多糖的提取 采用微波提取法［15］提取膜莢黃芪苗中的多糖：準確稱取0.1 g樣品，加入3 mL的蒸餾水。調節超聲波功率為65W，溫度65℃，超聲30 min，靜置10 min，抽取上清液加入2倍體積的無水乙醇，離心得到的沉淀即為黃芪多糖，用蒸餾水溶解得到的即為多糖樣品溶液。

1.5.2 黃芪多糖含量的測定 采用苯酚－硫酸比色法測定膜莢黃芪多糖含量，具體的方法參照陳玉霞等的方法［14］：準確稱取葡萄糖標準品10 mg，用蒸餾水溶解定容至100 mL，制成葡萄糖濃度為0.1 mg／mL的標準溶液。分別準確量取對照品溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于容量瓶中，分別加入1 mL的5%苯酚溶液，搖勻后再加入5 mL的濃硫酸，在沸水中加熱15 min，取出迅速放入冷水中30 min。取出后測定在490 nm波長處的吸光度，以標準溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線 y＝0.243 2x－0.007 54，r2＝0.995 4。

取0.5 mL樣品溶液，空白對照組為取樣0 mL，參考標準曲線制備方法中的“加入1 mL的5%苯酚溶液”起至“測定樣品溶液的吸光度”，通過標準曲線方程，計算樣品溶液多糖的含量。

1.6 黃芪抗氧化活性的測定

參照Kilani等的方法［16］測定膜莢黃芪抗氧化活性。準確抽取樣品溶液0.5 mL，加入1 mL 200μmol／L DPPH溶液，在室溫下暗反應35 min，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率 A＝［1－－）］100%［16］；式中：D［17］i為DPPH與樣品溶液混合液的吸光度；為無水乙醇與樣品溶液混合液的吸光度為無水乙醇與DPPH混合液的吸光度。

1.7 分析數據

利用SPSS軟件對試驗數據進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同生長時期黃芪苗生物量

由圖1可見，膜莢黃芪苗在培養前期與對照組相比無明顯差異，而在培養3、7 d時隨水楊酸濃度的增加，觀察到黃芪苗生物量逐漸下降。當水楊酸濃度為200、400μmol／L時，觀察到黃芪生物量顯著下降，并隨水楊酸濃度增加下降越明顯；而當水楊酸濃度為100μmol／L時，與對照組相比無明顯差異，下降幅度小。這與觀察到的黃芪幼苗生長的表型相吻合。隨著培養時間和水楊酸濃度的增加，黃芪幼苗逐漸表現出生長力減弱、葉片萎蔫的現象。在培養7 d后，黃芪植株葉片黃化甚至出現死亡。

2.2 水楊酸濃度對黃芪苗總黃酮含量的影響

由圖2可知，不同水楊酸濃度對黃芪苗總黃酮的積累產生重要的影響。膜莢黃芪苗在培養1 d時總黃酮含量與對照組出現明顯差異，在低濃度水楊酸（100、200μmol／L）下總黃酮顯著增加，在高濃度水楊酸（400μmol／L）下總黃酮量又顯著高于低濃度下的總黃酮量。但是隨著培養時間的延長，400μmol／L水楊酸處理的試驗組總黃酮量增加的速度明顯減慢，基本保持不變，無明顯差異；而低濃度水楊酸處理的試驗組總黃酮量仍明顯的提高。對比100μmol／L水楊酸與200μmol／L水楊酸的試驗組，培養天數為 3、7 d時，200μmol／L水楊酸的試驗組黃芪苗總黃酮增加量顯著高于100μmol／L水楊酸的試驗組，而100μmol／L水楊酸的試驗組總黃酮的含量無明顯差異，在培養7 d后達到最大值（85.13μg／g）。雖然400μmol／L水楊酸處理的試驗組總黃酮量高于100μmol／L水楊酸與200μmol／L水楊酸的試驗組，但是400μmol／L水楊酸處理的黃芪苗生長勢弱且出現死亡的植株，不利于植株的生長。隨著培養天數的增加，不同濃度水楊酸處理后黃芪苗中總黃酮的積累量逐漸增加，均明顯高于對照組，表明水楊酸對黃芪苗總黃酮的積累具有促進作用。這與杜研等的研究中低濃度水楊酸能夠提高黃芪愈傷組織中總黃酮含量的結果［10］相同。黃芪在400μmol／L水楊酸濃度下產生了激素脅迫，對植物細胞具有毒害作用［10］。雖然高濃度水楊酸（400μmol／L）促進總黃酮積累量的增加，但是植株死亡的現象更加嚴重，與對照組相比，植株的生物量明顯下降。

2.3 水楊酸濃度對黃芪苗多糖含量的影響

由圖3可知，培養1 d時，與對照相比，黃芪植株多糖含量明顯提高，但試驗組之間多糖含量基本相同，差異不顯著，原因可能是由于培養天數過短，水楊酸未對植株產生明顯的刺激作用；培養3、7 d時，隨著水楊酸濃度的增加，黃芪幼苗中多糖的積累有1個波峰。在100、200μmol／L水楊酸濃度下觀察到多糖含量明顯提高，在200μmol／L水楊酸濃度下培養7 d達到最大值（8.12 mg／g）；在 400μmol／L水楊酸濃度下多糖的含量急劇下降，僅僅大于對照組。結果說明，多糖的積累與水楊酸濃度和培養時間緊密相關，低濃度的水楊酸（100、200μmol／L）促進黃芪幼苗多糖的積累，而高濃度的水楊酸（400μmol／L）對植株形成激素脅迫，植株的生長和組織結構受到破壞，促使植株新陳代謝減慢甚至停止，而原有積累的多糖逐漸降解和破壞［9］，以抵抗外界環境的改變。

2.4 水楊酸濃度對黃芪苗抗氧化活性的影響

總黃酮最重要的特性為抗氧化活性，因此通過測定DPPH自由基清除率確定黃芪苗生長過程中的抗氧化活性。由圖4可知，DPPH自由基清除率表示了黃芪幼苗不同生長時期的抗氧化活性。自由基清除率隨著培養天數和水楊酸濃度增加呈現上升的趨勢，與黃芪幼苗總黃酮含量成正相關。在培養7 d后，對照組與試驗組清除自由基能力達到最大值，且400μmol／L水楊酸處理的試驗組清除自由基的能力最強，明顯高于其他試驗組。雖然400μmol／L水楊酸處理試驗組的植株生長勢最差，甚至出現死亡的植株，有可能是因為高濃度水楊酸超出植株的承受能力，形成激素脅迫，抑制黃芪幼苗的生長，但是黃芪幼苗為抵制水楊酸逆境脅迫，提高植株植保素及其相關合成酶類、蛋白含量和各種防御機制，從而提高植物次生代謝產物的含量，促進植株體內總黃酮和多糖等次生代謝產物的積累，出現了400μmol／L水楊酸處理的試驗組清除自由基能力最強的現象［7］。

3 結論

水楊酸有效地誘導了膜莢黃芪活性成分的積累，在低濃度水楊酸（100、200μmol／L）能夠有效促進總黃酮和多糖的積累，從而進一步提高自由基清除率，但是高濃度水楊酸（400μmol／L）不利于多糖和黃芪生物量的積累，高濃度水楊酸對植株形成激素脅迫，抑制植株的生長。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學工業出版社，2009.

［2］張 薔，高文遠，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進展［J］.中國中藥雜志，2012，37（21）：3203－3207.

［3］韓 燕.中藥黃芪的研究概況［J］.河南中醫學院學報，2003，18（6）：86－88.

［4］秦嘉澤，全雪麗，田海麗，等.長白山野生膜莢黃芪不定根總黃酮積累規律研究（Ⅰ）［J］.北方園藝，2014（16）：158－160.

［5］楊映雪，陳建業，王亞平.黃芪總黃酮的抗氧化作用［J］.川北醫學院學報，2007，22（6）：606－608.

［6］董娟娥，梁宗鎖.植物次生代謝物積累量影響因素分析［J］.西北植物學報，2004，24（10）：1979－1983.

［7］孟雪嬌，丁國華，邸 昆.水楊酸在植物體內的生理作用的研究進展［J］.中國農學通報，2010，26（15）：207－214.

［8］彭 潔，宋文路，王曉強，等.水楊酸與植物抗性關系研究進展［J］.園藝與種苗，2016（2）：70－74.

［9］唐艷萍，文 濤，孫 歆，等.水楊酸對植物光合作用影響的研究進展［J］.西北植物學報，2015，35（8）：1701－1708.

［10］杜 研.誘導子對黃芪愈傷組織生長及代謝的影響［D］.長春：吉林農業大學，2007.

［11］Tewari R K，Paek K Y.Salicylic acid－induced nitric oxide and ROSgeneration stimulate ginsenoside accumulation in Panax ginseng roots［J］.Journal of Plant Growth Regulation，2011，30（4）：396－404.

［12］Wu S Q，Lian M L，Gao R，et al.Bioreactor application on adventitious root culture of Astragalusmembranaceus［J］.In Vitro Cellular＆Developmental Biology－Plant，2011，47（6）：719－724.

［13］呂鳳嬌，謝曉蘭.黃芪總黃酮乙醇提取工藝研究［J］.安徽農業科學，2012，40（33）：16380－16382.

［14］李春紅，田 吉，何 兵，等.紫外分光光度法測定黃芪總黃酮的含量［J］.重慶醫科大學學報，2011，36（8）：954－956.

［15］陳玉霞，林 峰，莫 娟，等.兩種黃芪多糖提取方法比較［J］.實驗室研究與探索，2015，34（3）：20－22，30.

［16］Kilani S，Ammar R B，Bouhlel I，et al.Investigation of extracts from（Tunisian）Cyperus rotundus as antimutagens and radical scavengers［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2005，20（3）：478－484.

［17］鄭德勇，安鑫南.竹葉提取物清除DPPH自由基的測定方法［J］.福建農林大學學報（自然科學版），2005，34（1）：59－62.