中華補血草內生真菌發酵物的抑菌和抗氧化活性

毛 涵，陳 婧，代 飛，湯新慧，薛 菲

（1.江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室，江蘇鹽城224051；2.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816）

中華補血草［Limonium sinense（Girard）Kuntze］是白花丹科補血草屬植物，別稱匙葉草、鹽云草、海菠菜、海赤芍等，為多年生泌鹽草本植物，喜生于鹽漬化的低洼濕地上，廣泛分布于我國東北、華北、華東等地區［1］。現有研究發現，中華補血草具有刺激動物造血及補血、止血功能，其提取物具有調節免疫、保肝、抑制腫瘤、抗氧化、抑菌等多種藥理活性，具有較高的藥用價值［2］。近年來，國內外關于中華補血草的研究主要集中在其活性成分藥用價值等方面，對其內生菌篩選的研究較少［3－5］。

植物內生菌泛指一切生活在植物體內而不使植物組織顯示出明顯感染癥狀的腐生、寄生、共生真菌及細菌等微生物［6－7］。內生菌主要包括內生真菌、內生細菌、內生放線菌。研究發現，內生真菌普遍存在于目前已研究過的各種藥用植物中，在長期與藥用植物共生的過程中，它對藥用植物產生各種作用和影響，包括促進宿主植物生長發育、增強宿主植物的抗逆性、促進藥用植物次生代謝產物的合成等作用［8－9］。

因此，利用藥用植物內生真菌發酵生產生物活性物質，可以克服傳統的從植物中分離純化天然活性成分存在的周期長、受地域及其他條件限制等不足，為天然藥用活性物質的獲取開辟了新途徑。但目前，運用植物內生真菌發酵得到次級代謝產物的含量還較低，尚不能滿足工業化生產的要求，須要進一步探索和研究［10］。

本試驗以江蘇省鹽城市灘涂丹頂鶴自然保護區采到的野生中華補血草為材料，分離篩選其內生真菌，鑒定并研究其抗氧化和抑菌能力，以期為篩選出具有產生藥用價值代謝產物能力的菌種，及有效開發利用和保護本地區的中華補血草內生菌資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華補血草，于2017年3月11日采集于江蘇省鹽城市大豐灘涂。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus lutea）、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均購自中國菌種保藏中心。

L－抗壞血酸（維生素C）、水楊酸、次氯酸鈉、氫氧化鈉、二甲基亞砜、硫酸亞鐵、濃鹽酸、甲醇、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris－base）等均為分析純，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）、硫酸鏈霉素，均購自南京奧多福尼生物科技有限公司；察氏培養基，購自青島海博生物技術有限公司；瓊脂，購自上海伊卡生物技術有限公司；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑盒、96孔細胞培養板，均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫培養箱，均購自上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；TGL－16gR高速冷凍離心機，購自上海安亭科學儀器廠；EL204電子分析天平，購自梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺、JJ－2組織搗碎機、PHS－3C精密酸度計，均購自上海康華生化儀器制造有限公司；HH－6數顯恒溫水浴鍋，購自江蘇省金壇市三和儀器有限公司；DHG－9023A液晶鼓風干燥箱，購自江蘇省太倉市華利達實驗設備有限公司；WFJ2000可見分光光度計，購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；DYY－12型電泳儀，購自上海京工實業有限公司；PCR儀，購自上海賽默生物科技發展有限公司；IKE RV 10旋轉蒸發儀，購自鄭州長城科工貿易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 中華補血草的表面消毒 按照以下步驟對中華補血草的根和葉片進行表面消毒處理：無菌水沖洗植物表面，洗凈表面的泥土和灰塵，用5%次氯酸鈉浸泡5 min消毒，用25%硫代硫酸鈉浸泡10 min去除次氯酸鈉，無菌水浸泡5 min，70%乙醇消毒5 min，用無菌水清洗5～6遍，最后1遍無菌水進行表面涂布，檢驗植物表面是否消毒徹底［11］。

1.3.2 內生真菌的分離純化及保存 在無菌超凈工作臺上，把表面消毒后的根和葉片邊緣切去少許，以形成新的傷口，葉片剪成約5 mm×5 mm小塊，置于察氏固體培養基中，每個培養皿放入約3～4片，28℃倒置培養。每12 h觀察1次。待根和葉片切口處長出菌絲后，采用菌絲尖端挑取法，根據菌落形成時間、菌絲形態及顏色的差異，挑取少許菌落邊緣的菌絲，轉接到新鮮的察氏培養基上培養數日，并觀察記錄各菌落的形態特征。反復純化后，將菌株轉至察氏固體培養基斜面上，28℃培養3～5 d后，4℃冰箱保存［12－13］。

1.3.3 內生真菌的發酵物的制備 從純化的菌株中挑取少量菌絲于察氏培養基中，28℃，160 r／min振蕩培養3～5 d。用4層無菌紗布過濾除去菌體，用乙酸乙酯萃取5～8次后用旋轉蒸發儀濃縮，待大部分乙酸乙酯揮發后倒入小燒杯中，置于50℃水浴鍋蒸發濃縮至浸膏狀，得到各菌株的發酵產物。用30%二甲基亞砜分別稀釋各菌株的發酵產物至1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25μg／mL待用［14－15］。

1.3.4 發酵物抗氧化能力的檢測 分別采用DPPH自由基清除試驗、羥基自由基清除試驗來檢測發酵物的抗氧化活性［16－18］。

1.3.5 發酵物抑菌能力的檢測 以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌等5種菌為指示菌，利用牛津杯法［19］測定所篩菌株的抑菌活性；設定1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25μg／mL等 6個濃度梯度，利用MTT法［20］進一步研究其抑菌能力與濃度的關系。以上試驗均做3次重復。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

采用組織切塊法從中華補血草的根和葉片中篩選出其內生真菌，第3天發現培養基中組織塊切口處有菌落長出，其中有些真菌的生長速度相對較快，菌絲很快附著組織塊周圍，隨后對切口處的菌絲體進行多次分離和純化。由表1可知，最終在中華補血草中共得到11株內生真菌，其中5株來源于葉片，6株來源于根部。將分離獲得的菌株用無菌牙簽挑取少許菌絲到固體培養基上，每個培養皿中1～3處，培養5 d后觀察其生長情況和菌落特征，測量菌落直徑，具體情況如表1所示。

表1 中華補血草內生真菌的菌落形態特征

2.2 抗氧化試驗結果

2.2.1 DPPH自由基清除試驗結果 以維生素C作為對照，對篩選出的11株中華補血草內生真菌的發酵物進行清除DPPH自由基的抗氧化活性研究，發現菌株A－1－5、A－2－5、A－2－13等具有清除DPPH自由基的能力。由圖1可知，在不同的發酵物濃度下，3株菌株對DPPH自由基的清除能力表現為A－2－13＞A－2－5＞A－1－5，其中A－2－13表現優異，其發酵物對 DPPH清除率在 1 000.00、500.00、250.00、125.00μg／mL濃度下均超過 90%，與對照物維生素C的清除率接近，在 62.50、31.25μg／mL濃度下清除率分別達到65.4%、60.3%。菌株 A－2－5發酵物的清除率在1 000.00μg／mL時達到 73.73%，500.00μg／mL時達到5238%，25000、125.00μg／mL濃度下的清除率相當，分別為 3347%、34.56%，62.50、31.25μg／mL濃度下的清除率相當，分別為18.76%、16.78%。菌株A－1－5的清除率相對較小，其發酵物的濃度為1 000.00μg／mL時清除率最高，為41.07%，其發酵物的濃度為250.00μg／mL時清除率最低，為8.51%。

2.2.2 羥基自由基清除試驗 以維生素C作為對照，對分離篩選出的11株真菌的發酵物進行羥基自由基清除試驗，發現菌株A－1－8、A－2－5、A－2－8等具有清除羥基自由基的能力。由圖2可知，菌株 A－1－8、A－2－5、A－2－8的發酵物對羥基自由基清除能力均隨發酵物濃度的減小而下降。其中，菌株A－2－5表現出相對較高的羥基自由基清除能力，在 1 000.00、500.00、250.00、125.00μg／mL濃度下的清除率均高于90%，接近于對照物維生素C的清除率，在62.50μg／mL濃度下的清除率為75.5%，在31.25μg／mL濃度下的清除率為 35.72%；菌株 A－2－8的發酵物在1 000.00μg／mL濃度下的清除率最高，為 49.25%，在50000、250.00μg／mL濃度下的清除率分別為 38.79%、3601%，在 125.00μg／mL濃度下的清除率為 18.6%，在6250、31.25μg／mL濃度下沒有清除能力；菌株 A－1－8發酵物的清除能力相對較弱，在1 000.00μg／mL濃度下的清除率最高，為29.93%，在31.25μg／mL濃度下的清除率最低，僅為6.91%。

2.3 抑菌試驗結果

2.3.1 牛津杯法 本試驗對分離出來的11株真菌的發酵物進行抑菌活性研究，發現菌株A－1－5、A－1－8、A－1－16、A－2－3、A－2－5、A－2－7、A－2－8、A－2－13等8株菌株具有抑菌活性。由表2可知，8株內生真菌的發酵物對指示菌的抑菌效果良好，其中，菌株A－1－8、A－1－16、A－2－3、A－2－7、A－2－8等5株菌對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用，菌株A－1－5、A－2－5、A－2－13等3株菌對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均有抑制作用。相對而言，菌株 A－1－5、A－1－16、A－2－5、A－2－7、A－2－13等5株菌的抑菌作用較好，對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均為15～20 mm，對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑均大于25 mm。

2.3.2 MTT法 根據表2的研究結果選取抑菌活性較強的A－1－5、A－1－16、A－2－5、A－2－7、A－2－13等5株菌株做進一步研究，定量計算不同濃度梯度的發酵產物對上述5種指示菌的抑菌率大小及不同菌株發酵產物的最小抑菌濃度。

表2 8株中華補血草內生真菌對5種指示菌的抑菌活性測試結果

2.3.2.1 菌株A－1－5的發酵物對指示菌的抑菌試驗結果由圖3可知，在試驗濃度范圍內，菌株A－1－5的發酵物對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌等5種指示菌均有一定的抑制作用。其中，對枯草芽孢桿菌的抑菌作用最突出，在1 000.00、250.00μg／mL濃度下，抑菌率分別達到92.15%、96.55%；對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率隨發酵物濃度的降低而下降，抑菌率最高值分別為1 000.00μg／mL濃度下對應的4955%、34.83%、49.61%；對藤黃微球菌的抑制作用最弱，在1 000.00μg／mL濃度下，抑菌率僅為5.51%。在最低發酵物濃度下，抑菌率均較低，對大腸桿菌和乙型副傷寒沙門菌的抑菌率分別為12.34%、13.08%，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的抑菌率分別為 1.92%、2.70%、1.79%。

2.3.2.2 菌株A－1－16的發酵物對指示菌的抑菌試驗結果 由圖4可知，在試驗濃度范圍內，菌株A－1－16的發酵物對藤黃微球菌的抑制作用極弱，在1 000.00μg／mL濃度下，抑菌率僅為0.35%，對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等4種指示菌的抑菌率隨發酵物濃度的降低而下降。其中，對枯草芽孢桿菌的抑制作用突出，在不同發酵物濃度下其抑菌率均明顯高于其他指示菌。在1 00000μg／mL時，菌株A－1－16的發酵物對枯草芽孢桿菌的抑菌率為95.38%，而對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為 47.74%、45.40%、5417%；在 31.25μg／mL時，菌株 A－1－16的發酵物對枯草芽孢桿菌的抑菌率為23.12%，對另3種指示菌的抑菌率均低于10%。

2.3.2.3 菌株A－2－5的發酵物對指示菌的抑菌試驗結果由圖5可知，菌株A－2－5的發酵物對5種指標菌的抑菌率均隨發酵物濃度的降低而下降。其中，對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，在1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，為93.97%，在 31.25μg／mL濃度下的抑菌率最低，為 16.81%；對大腸桿菌和乙型副傷寒沙門菌在31.25μg／mL濃度下沒有抑制作用，在1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，分別為5679%、50.22%，在62.50μg／mL濃度下的抑菌率最低，分別為1513%、6.57%；對金黃色葡萄球菌，當發酵物濃度低于250.00μg／mL時沒有抑菌活性，在 1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，為51.81%，在250.00μg／mL濃度下的抑菌率最低，為30.45%；對藤黃微球菌的抑菌率較低，不同發酵物濃度下均低于10%。

2.3.2.4 菌株A－2－7的發酵物對指示菌的抑菌試驗結果由圖6可知，菌株A－2－7的發酵物對藤黃微球菌沒有抑制作用，對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，在1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，達 93.19%；對大腸桿菌在1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，為43.64%，在3125μg／mL濃度下的抑菌率最低，為2.08%；對乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌在31.25μg／mL濃度下沒有抑制作用，在 1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最 高，分別為3616%、4625%，在62.50μg／mL濃度下的抑菌率最低，分別為 995%、3.09%。4287%、42.10%，在62.5μg／mL濃度下的抑菌率均最低，分別為4.15%、11.74%；對乙型副傷寒沙門菌在1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，為12.49%，在125.00μg／mL濃度下的抑菌率最低，為1.37%；對金黃色葡萄球菌在1 000.00μg／mL濃度下的抑菌率最高，為14.10%，在250.00μg／mL濃度下的抑菌率最低，為1.91%；對藤黃微球菌的抑制作用最弱，在1 000.00、500.00μg／mL濃度下的抑菌率分別僅為 4.21%、1.78%。

3 結論與討論

內生真菌普遍存在于植物中，不同的植物能夠分離得到不同種類和數量的內生真菌，即使是同一植物也會由于環境、消毒和分離方法的不同而存在差異。本試驗采用組織塊分離法從中華補血草的根和葉片中分離出11株內生真菌，其中5株來自于葉片，6株來自于根。

對篩選出的11株內生真菌的發酵物進行抗氧化試驗，發現菌株A－2－13、A－1－5、A－2－5、A－1－8、A－2－8等具有一定的抗氧化活性，其中在 1 000.00、500.00、25000、125.00μg／mL濃度下菌株A－2－13對DPPH自由基的清除率及菌株A－2－5對羥基自由基的清除率均高于90%。

對篩選出的內生真菌的發酵物進行抑菌試驗，發現菌株A－1－5、A－1－16、A－2－5、A－2－7、A－2－13等發酵物的抑菌活性較強，其中對枯草芽孢桿菌的抑制作用最強，抑菌率幾乎均高于90%，對大腸桿菌、乙型副傷寒沙門菌以及金黃色葡萄球菌的抑制作用略低，抑菌率在35%～55%之間，對藤黃微球菌的抑制作用最弱，抑菌率均低于10%。

本試驗的結果表明，從野生中華補血草中篩選出的內生真菌具有一定的抗氧化活性和抑菌活性，本研究僅對其做了初步的探討，其發酵液中活性成分的產量與發酵條件之間有無關系，以及活性成分能否作為藥用資源開發利用等均有待進一步研究。

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