茅蒼術葉片蛋白提取方法的比較

張文明，巢建國，谷 巍，陸奇杰，侯皓然

（南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210023）

茅蒼術［Atractylodes lancea（Thunb.）DC.］為菊科多年生草本，其根莖具有燥濕健脾、祛風散寒、明目之功效［1］。近年來，由于種種環境脅迫和人為因素等對茅蒼術的品質和資源儲量造成了嚴重影響，已被江蘇省列為珍稀瀕危藥用植物之一。曾燕等研究結果表明，30℃以上的高溫脅迫會限制茅蒼術的生長，但有利于其主要活性成分揮發油的積累［2］。顧永華等研究結果表明，果后期對茅蒼術進行適宜的澇漬脅迫有利于提高其根莖生長及揮發油含量［3］。目前，對茅蒼術這些抗逆機制的研究尚未見報道。因此，從蛋白質角度能更好了解逆境對茅蒼術各種生化和信號途徑的影響［4］，對弄清茅蒼術的一系列抗逆分子機制具有重要意義。而蛋白質的提取是茅蒼術蛋白質水平研究的重要一步，對這方面研究尚未報道。本試驗以茅蒼術葉片為原料，對茅蒼術葉片蛋白質的提取方法及工藝條件進行研究，并運用SDS－PAGE法對其進行分析，在此基礎上建立適宜茅蒼術葉片蛋白提取和SDS－PAGE的一套方法，以期為茅蒼術蛋白質組學研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為江蘇省鎮江茅山地區的茅蒼術，種植于南京中醫藥大學藥用植物園內。經南京中醫藥大學中藥資源與鑒定系巢建國教授鑒定為菊科植物茅蒼術。

彩虹245廣譜蛋白Maker，膽酰胺基丙基二甲基銨基丙磺酸鹽（CHAPS），乙二胺四乙酸（EDTA），聚乙烯吡咯烷酮（PVP，北京索萊寶科技有限公司）；二硫蘇糖醇（DTT，上海阿拉丁生化科技有限公司）；牛血清白蛋白（上海惠興生化試劑有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris），鹽酸（HCl）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.2 儀器設備

Mini Trans－BlotCell型電泳槽和 PowerPac Basic系列電泳儀，美國Bio－Rad公司；UV－1800PC紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；SIGMA3－18K高速冷凍離心機，北京博勱行儀器有限公司；Tanon－5200Multi多功能成像系統，上海天能科技有限公司。

1.3 蛋白質提取方法

1.3.1 直接提取法 取0.2 g茅蒼術葉片，按其鮮質量的10%加入 PVP，按 1 g∶1 mL加入蛋白提取液（50 mmol／L Tris－HCl，pH值 7.0），在 0℃ 低溫下研碎，于 4℃、12 000 r／min離心 20 min，取上清液作為待測蛋白上樣液［5］。

1.3.2 TCA－丙酮法 取0.2 g茅蒼術葉片加入液氮研磨完全，加入2 mL預冷的含體積分數10%TCA、0.07%β－巰基乙醇（β－Me）丙酮溶液，混勻完全后于－20℃靜置2 h，4℃、12 000 r／min離心20min，棄上清液。于沉淀物中加入2mL含0.07%β－Me預冷丙酮溶液，在－20℃下靜置2 h，于4℃、12 000 r／min條件下離心20 min，重復漂洗2次。最后加入2 mL預冷的80%丙酮溶液洗滌沉淀物，在4℃、12 000 r／min條件下離心20min，于－20℃下揮干，即得蛋白粉末［6］。

1.3.3 Tris－丙酮法 取0.2 g茅蒼術葉片于液氮中研磨完全，立即加入 2 mL提取緩沖液［0.04 mol／L Tris－base，5 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、20 mg／mL CHAPS、50 mg／mL PVP，20 mg／mLβ－Me］，完全混勻后在 4℃、12 000 r／min離心20 min，取上清液，加入4倍體積預冷的含 0.07% β－Me的丙酮溶液進行漂洗，在－20℃冰箱中靜置2 h后于4℃、12 000 r／min下離心20 min，得沉淀，然后用預冷的含0.07%β－Me丙酮溶液漂洗沉淀，振蕩混勻，－20℃下靜置2 h，于4℃、12 000 r／min下離心20 min，收集沉淀，重復漂洗3次。收集的沉淀物在－20℃下揮干，即得蛋白粉末［7－8］。

1.3.4 Tris－飽和酚法 稱取0.2 g茅蒼術葉片加液氮充分研磨，加 1 mL蛋白提取液［0.1 mol／L Tris－HCl（pH值8.8）、0.01 mol／L EDTA、4%β－Me、0.9 mol／L蔗糖］和 1 mL Tris－飽和酚（pH值8.5），研磨30 s，轉入離心管。4℃混勻，于4℃、12 000 r／min離心20 min。取上層酚相0.4 mL至無菌離心管中，加入4倍體積預冷的含0.1 mol／L的乙酸銨甲醇溶液，混勻，－20℃放置2 h，4℃、12 000 r／min離心20min，棄上清。沉淀依次用預冷的含 0.1 mol／L乙酸銨、0.01 mol／L DTT的甲醇溶液和預冷的含0.01 mol／L DTT的80%甲醇溶液各清洗2次，所得沉淀 －20℃ 揮干，即得蛋白粉末［9－10］。

1.4 蛋白提取液的裂解和含量測定

分別取上述提取所得的蛋白粉末70 mg，加入700μL裂解液（8 mol／L尿素、2 mol／L硫脲、40 mg／mL CHAPS、1%DTT），在25℃超聲清洗器中超聲處理，每次5 min，間隔期間振蕩30 s，超聲處理 40 min后，于 4℃、12 000 r／min離心20 min，移取上清液至新的離心管，即為待測蛋白上樣液［8］。用Bradford法［11］作標準曲線測定蛋白含量。

1.5 凝膠制備

用PowerPac Basic系列電泳儀進行SDS－PAGE分析，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電極緩沖液為pH值8.8的Tris－甘氨酸緩沖液。將待測蛋白上樣液與SDS－PAGE蛋白上樣緩沖液（6×）混勻后，100℃加熱5 min，以充分變性蛋白。每條泳道上樣量均是20μL，先于90 V恒壓電泳30min，再120 V恒壓電泳約60 min，當溴酚藍指示劑距膠板下緣約1 cm時結束電泳。凝膠板浸于0.1%考馬斯亮藍R250中染色約2 h，再換成脫色液，搖床上脫色至背景基本無色。

1.6 圖像分析

膠板用Tanon－5200Multi多功能成像系統拍照，使用Quantity One軟件進行圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法蛋白終產物的比較

對4種蛋白質提取方法得到的茅蒼術葉片蛋白的呈現形式、顏色、提取時間、蛋白含量進行比較，從表1可以看出，直接提取法雖然耗時較短，但是所得終產物顏色是綠色，蛋白含量偏低，可能是由于茅蒼術葉片含有較多色素未被完全分解；TCA－丙酮法、Tris－丙酮法蛋白含量較高，但提取時間過長，操作繁瑣。同時，TCA－丙酮法提取的蛋白經多次漂洗后顏色仍呈淡黃色，這可能是由于茅蒼術葉片中的某些成分和蛋白共沉淀，造成提取的蛋白不純。Tris－飽和酚法加入裂解液后易溶解，提取的蛋白揮干后呈白色，對非蛋白物質去除有很好的效果，且提取時間相對較短。

2.2 不同提取方法所得蛋白含量的比較

以牛血清蛋白作為標準蛋白，待測蛋白上樣液濃度采用Bradford法作標準曲線測定蛋白含量，標準曲線見圖1。測得TCA－丙酮法提取獲得的蛋白干粉質量為（3.05±0.133）g、Tris－丙酮法提取獲得的蛋白干粉質量為（4.23±0.098）g、Tris－飽和酚法提取所獲得的蛋白干粉質量為（3.31±0923）g，表明3種提取方法在蛋白干粉質量上沒有達到明顯差異。

表1 不同提取方法對茅蒼術葉片蛋白終產物的影響

2.3 不同提取方法SDS－PAGE電泳圖譜分析

從圖2可以看出，直接提取法、TCA－丙酮法有8、7條標準蛋白譜帶，蛋白條帶均著色較淺，且小分子蛋白條帶缺失嚴重，均不適合茅蒼術葉片的電泳分析。Tris－丙酮法獲得的標準蛋白譜帶為11條，背景顏色較為清晰，條帶亦可清楚辨認，但在25～80 ku范圍內缺失部分蛋白，測得蛋白種類不全。Tris－飽和酚法獲得的標準蛋白譜帶為14條，與Tris－丙酮法的蛋白譜帶模式相似，在17～245 ku的范圍內分布較為均勻，條帶可清晰辨別。

3 討論與結論

理想蛋白樣品的制備在蛋白質組學的研究中具有重要作用，同時由于植物個體、器官、組織化學成分等差異造成其蛋白提取方法各不相同［12－13］。本研究從蛋白含量、純度、提取時間方面，運用SDS－PAGE技術對茅蒼術葉片蛋白提取方法進行比較。結果表明，不同提取方法得到的蛋白純度和含量有明顯不同，對蛋白條帶的形成產生了直接影響。直接提取法雖然提取時間最短，但其蛋白含量和純度較低，條帶著色淺難以鑒別。TCA－丙酮法耗時最長，得到的蛋白沉淀為淡黃色，溶解性較差，可能是由于高含量的蛋白中摻入了較多雜質。Tris－丙酮法提取蛋白純度較高，且譜帶背景清晰，但在25～80 ku范圍內缺失部分蛋白，可能是由于CHAPS與蛋白結合后未能去除完全的原因。Tris－飽和酚法提取的蛋白條帶和Tris－丙酮法相比雖然背景色較深，但在17～245 ku范圍內分布較為均勻，條帶仍可清晰辨別。其次在提取時間和蛋白純度上Tris－飽和酚法均有良好效果，這與飽和酚的性質有很大關系。飽和酚良好的溶解性，能使茅蒼術葉片中可溶性雜質溶解在水中，而蛋白質和脂類溶解在飽和酚中，同時利用乙酸銨甲醇溶液對其沉淀純化，亦避免新離子的加入［14］，更適合茅蒼術葉片蛋白質的提取。本研究結果可為逆境脅迫下茅蒼術分子機制在蛋白質水平下的變化研究提供基礎資料。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2015：204.

［2］曾 燕，郭蘭萍，陳保冬，等.不同溫度對茅蒼術生長發育及揮發油組分的影響［J］.世界科學技術（中醫藥現代化），2010，12（5）：773－778.

［3］顧永華，馮 煦，夏 冰.水分脅迫對茅蒼術根莖生長及揮發油含量的影響［J］.植物資源與環境學報，2008，17（3）：23－27.

［4］陳 飛，周 彤，魏宇佳，等.茅蒼術質膜蛋白的制備及其雙向電泳蛋白質組學平臺的構建［J］.生物技術通報，2016，32（9）：72－82.

［5］谷瑞升，劉群錄，陳雪梅，等.木本植物蛋白提取和SDS－PAGE分析方法的比較和優化［J］.植物學通報，1999，16（2）：171－177.

［6］華貴煌，董 燕，易 浪，等.魚腥草葉片總蛋白的提取及雙向電泳體系的建立［J］.廣州中醫藥大學報，2013，30（3）：375－378.

［7］Xiang F，Xu L，Wang Y，et al.Effective method of leaf protein extraction for proteomic analysis in radish［J］.Molecular Plant Breeding，2012，10（6）：756－760.

［8］陳富成，祁建民，徐建堂，等.圓果種黃麻功能葉總蛋白提取方法及雙向電泳體系的優化［J］.作物學報，2011，37（2）：369－373.

［9］張 寧，孫曉麗，端木慧子，等.野生大豆葉片蛋白質組雙向電泳技術體系的優化研究［J］.大豆科學，2015，34（5）：874－880.

［10］劉 楠，高 飛，周宜君，等.蒙古沙冬青根蛋白的提取及雙向電泳體系的建立［J］.北京師范大學學報（自然科學版），2013，49（4）：365－368.

［11］丁金鵬，張 娜，李 群.獨行菜屬植物種子總蛋白4種提取方法的比較［J］.新疆農業科學，2017，54（7）：1305－1312.

［12］沈少炎，吳玉香，榮俊冬，等.兩種花吊絲竹葉片蛋白提取方法的2－DE比較［J］.福建農林大學學報（自然科學版），2017，46（1）：50－57.

［13］Alam M，Ghosh W.Optimization of a phenol extraction－based protein preparation method amenable to downstream 2－DE and MALDI－MSbased analysis of bacterial proteomes［J］.Proteomics，2014，14（2／3）：216－221.

［14］高 芳.雪蓮組織中蛋白質提取方法比較［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（15）：32－34.