茶樹菇β－葡萄糖苷酶的純化及應用研究

陳 杏，楊成麗，鮑炳鑫，張 璇，蒲姝瑾，張煦彤，李大力，石若夫

（南京理工大學生物工程系，江蘇南京210094）

β－葡萄糖苷酶屬于水解酶類，它能催化β－D－糖苷類物質生成葡萄糖和糖苷配基。β－葡萄糖苷酶在生物體內廣泛存在，包括細菌［1－2］、真菌［3－4］、植物［5－6］、動物［7－8］。β－葡萄糖苷酶在食品、醫藥工業等領域具有重要的應用價值。β－葡萄糖苷酶不僅能水解食品中β－糖苷類的風味前體物質［9］，而且能制備多種藥物活性分子，如京尼平［10］、大豆異黃酮苷元［11］、人參皂苷［12］。此外，β－葡萄糖苷酶在纖維素生物質的資源化領域有著不可替代的作用［13－14］。茶樹菇是一類具有大型子實體的可食性真菌。在茶樹菇的整個菌絲生長和出菇期間，分泌大量胞外β－葡萄糖苷酶，促進菌絲細胞對纖維素等大分子物質的降解和子實體的生長發育［15］。因此，茶樹菇是一種能分泌高產量、安全性高的β－葡萄糖苷酶的酶源。目前，還未見研究茶樹菇中β－葡萄糖苷酶的報道。我國是中藥大國，提取有效成分后的中藥殘渣一般含有豐富的粗纖維，但這些殘渣大多被當作廢物垃圾處理。中草藥提取生物活性成分的加工過程包括碾碎［16］、堿處理［17］、有機溶劑處理［18］等，因此，通過生物催化方法降解中藥殘渣，可簡化預處理過程，而且得到的葡萄糖可作為一種重要的碳源，成為微生物發酵生產乙醇、甲醇的重要原料。本研究從茶樹菇中分離純化得到β－葡萄糖苷酶，并初步探索了茶樹菇β－葡萄糖苷酶和纖維素酶對提取喜樹堿后喜樹果渣的協同糖化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹菇子實體購自江蘇省南京市孝陵衛農貿市場，對硝基苯－β－D－葡萄糖苷（pNPG）購自Aladdin公司。其他試驗所用的試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。主要試驗設備為高速冷凍離心機（himac CR21G）、紫外－可見分光光度計（HITACHI）、數顯高速均質機（杭州齊威儀器有限公司）、切向流超濾裝置（Millipore Pellicon－2）、制備電泳儀（BIO－RAD 491型）。

1.2 方法

1.2.1 茶樹菇β－葡萄糖苷酶的分離純化 稱取茶樹菇子實體，充分勻漿，紗布過濾得到濾過液，將濾過液于4℃、10 000 g下離心10 min，上清液即為粗酶液。依次使用截留分子量為500、10 ku的超濾膜進行濃縮分離，得到的酶液經40%～85%飽和度的硫酸銨分級沉淀后，透析。利用美國BIO－RAD 491型制備型電泳儀純化酶蛋白。以5%濃縮膠和10%分離膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用磷酸緩沖液（50 mmol／L，pH值 7.0）洗脫。電泳過程在低溫下進行，工作電壓為200 V。

將純化后的酶蛋白分別進行Native－PAGE和SDSPAGE。Native－PAGE使用含0.05%的β－D－葡萄糖苷－4－甲基傘形酯的瓊脂覆蓋層染色［19］。

1.2.2 β－葡萄糖苷酶活性測定方法 在1 mL檸檬酸 －Na2HPO4緩沖液（50 mmol／L，pH值 6.0）中加入 100μL pNPG（8 mmol／L），再加入100μL酶液，50℃反應 10 min，然后加入 1.5 mL Na2CO3（0.1 mmol／L）終止反應，在 410 nm下測定吸光度的變化?？瞻讓φ沼谜麴s水代替酶液。酶活單位定義：在最適反應條件下，1 min催化生成1μmol的對硝基苯酚所需要的酶量定為1個酶活單位（U）。

1.2.3 最適pH值和溫度的測定 配制不同pH值的檸檬酸 －Na2HPO4緩沖液，pH值為3.0～8.0，濃度為50 mmol／L，測定酶在不同pH值緩沖液中的酶活性以考察酶反應的最適pH值。通過測定酶在不同溫度中的酶活性以考察酶反應的最適溫度，溫度水平為20～80℃。

1.2.4 β－葡萄糖苷酶穩定性的測定 將β－葡萄糖苷酶分別放置在不同pH值的檸檬酸－Na2HPO4緩沖液（pH值5.0、6.0、8.0）中，于4、50℃保存不同時間（0～3 h），以 30 min為間隔取樣，在最適反應條件下測定殘留酶活性。

1.2.5 β－葡萄糖苷酶動力學參數的測定 反應體系中，加入 pNPG的終濃度為 6.67～666.7μmol／L，得到不同 pNPG濃度下的反應速率。米氏常數Km和最大反應速率Vmax根據試驗數據通過雙倒數作圖法求得。

1.2.6 茶樹菇β－葡萄糖苷酶與纖維素酶協同糖化提取喜樹堿后喜樹殘渣的研究 從成年喜樹上采集果實，曬干并粉碎成粉末，稱取10 g喜樹果實的粉末，加入100 mL 90%乙醇，在70℃下浸提1 h，將料液離心，回收殘渣，經水洗、干燥后，作為糖化的原料。

以乙醇浸提的喜樹果實殘渣為原料，對β－葡萄糖苷酶與纖維素酶協同糖化作用進行研究。在1.6 mL檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（50 mmol／L，pH值 6.0）中，殘渣的濃度為0625%，同時加入纖維素酶（30 U）和β－葡萄糖苷酶（1 U），50℃下水解48 h，比較單酶法（纖維素酶）和雙酶法（β－葡萄糖苷酶與纖維素酶）處理殘渣時還原糖和葡萄糖含量隨時間的變化情況。

2 結果與分析

2.1 β－葡萄糖苷酶分離純化結果

經分離純化得到的酶液Native－PAGE和SDS－PAGE結果如圖1所示。制備電泳純化的酶液經 Native－PAGE，β－葡萄糖苷酶活性區域在紫外線觀察下顯示為熒光條帶，將此凝膠進一步使用考馬斯亮藍染色，出現單一條帶，說明得到了純化的β－葡萄糖苷酶。將制備電泳純化的酶液和蛋白分子量 Marker經 SDS－PAGE，并使用考馬斯亮藍染色，β－葡萄糖苷酶染色后出現單一條帶，與蛋白分子量Marker比較，β－葡萄糖苷酶的相對分子質量為26 ku。

2.2 β－葡萄糖苷酶的最適pH值和溫度

pH值對酶活性的影響如圖2所示，β－葡萄糖苷酶在pH值6.0下酶活性最大，在pH值5.5～6.5范圍內時，酶活性保持在85%以上，當pH值＜5.5或者pH值＞6.5時，酶活性下降明顯。溫度對酶活性的影響如圖3所示，β－葡萄糖苷酶在50～55℃下表現出最大的催化反應活性，在較低的溫度范圍（20～50℃）內，β－葡萄糖苷酶的反應速率隨溫度升高而增大，但當溫度高于55℃后，酶活性急劇下降。

2.3 β－葡萄糖苷酶的pH值耐受性和溫度耐受性

如圖4所示，在pH值 6.0、4℃下，β－葡萄糖苷酶的酶活性基本不變。在最適反應條件（pH值 6.0、50℃）下，1 h后，酶活性剩余80%以上；3 h后，酶活性剩余60%以上。在環境溫度為50℃下，β－葡萄糖苷酶在pH值6.0的耐受性高于 pH值5.0和 pH值8.0。

2.4 β－葡萄糖苷酶的動力學參數

β－葡萄糖苷酶對底物pNPG的水解反應符合米氏方程，雙倒數作圖法計算得出米氏常數Km為0.114 mmol／L，最大反應速率 Vmax為 10.96μmol／（L·min）。

2.5 茶樹菇β－葡萄糖苷酶與纖維素酶協同糖化喜樹殘渣

本試驗使用的原料為乙醇浸提喜樹堿后的喜樹果渣，研究茶樹菇β－葡萄糖苷酶與纖維素酶對其的協同糖化作用。圖5為單酶法和雙酶法水解喜樹果渣生成葡萄糖和還原糖的含量隨水解時間變化的情況。從圖5可知，雙酶水解48 h后，還原糖與葡萄糖的含量分別為 0.90、0.69 mg／mL，相比于單酶（纖維素酶）處理提高了39.17% 、48.15%。因此，以喜樹殘渣為原料酶法制備葡萄糖時，雙酶法相較于單酶法葡萄糖的生成量明顯增加。

3 討論與結論

茶樹菇β－葡萄糖苷酶的相對分子量為26 ku，最適溫度及最適pH值分別為50℃和6.0，在最適反應條件下具有較好的溫度和pH值耐受性。以乙醇浸提喜樹堿后的喜樹果渣為原料，經β－葡萄糖苷酶和纖維素酶的協同水解作用后，還原糖和葡萄糖的生成量有明顯增加。本試驗對中藥殘渣進行了再利用，有利于解決殘渣堆積造成的環境污染問題，實現中藥殘渣的資源化和價值提升。

參考文獻：

［1］Asha BM，Pathma J，Sakthivel N.Isolation and characterization of a novel thermostableβ－glucosidase from Bacillus subtilis SU40［J］.Applied Biochemistry and Microbiology，2015，51（1）：21－26.

［2］Dong M，Fan M T，Zhang Z，et al.Purification and characterization of β－glucosidase from Oenococcus oeni 31MBR［J］.European Food Research and Technology，2014，239（6）：995－1001.

［3］Park A R，Hong JH，Kim J J，et al.Biochemical characterization of an extracellularβ－glucosidase from the fungus，Penicillium italicum，isolated from rotten citrus peel［J］.Mycobiology，2012，40（3）：173－180.

［4］Rashid M H，Siddiqui K S.Purification and characterization ofbetaglucosidase from Aspergillus niger［J］.Folia Microbiologica，2016，19（3）：652－661.

［5］Sener A.Extraction，partial purification and determination of some biochemical properties ofβ－glucosidase from tea leaves（Camellia sinensis L.）［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，52（12）：8322－8328.

［6］Espindola Mateos S，Matias Cervantes C A，Slomianny M C，et al.Purification and partial characterization ofβ－glucosidase in chayote（Sechium edule）［J］.Molecules，2015，20（10）：19372－19392.

［7］Akemi U C，Tokuda G，Watanabe H A，et al.A novel glucosetolerantβ－glucosidase from the salivary gland of the termite Nasutitermes takasagoensis［J］.Journal of General and Applied Microbiology，2013，59（2）：141－145.

［8］Pontoh J，Low N H.Purification and characterization ofβglucosidase from honey bees（Apismellifera）［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2002，32（6）：679－690.

［9］Agrawal R V A，Satlewal A.Application of nanoparticleimmobilized thermostableβ－glucosidase for improving the sugarcane juice properties［J］. Innovative Food Science ＆ Emerging Technologies，2016，33：472－482.

［10］Gong G，Zheng Z，Liu H，et al.Purification and characterization of a β－glucosidase from Aspergillus niger and its application in the hydrolysis of geniposide to genipin［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2014，24（6）：788－794.

［11］Maitan－Alfenas G P，de Alage L G，de Almeida M N，et al.Hydrolysis of soybean isoflavones by Debaryomyceshansenii UFV－1 immobilised cells and freeβ－glucosidase［J］.Food Chemistry，2014，146（1）：429－436.

［12］Xu C C，Yu B H，Wang H L，et al.Transformation of minor ginsenoside Rd and CK by recombinant thermostableβ－glucosidase［J］.Chemical Journal of Chinese Universities，2016，37（2）：281－289.

［13］Borges D G，Baraldo Junior A，Farinas C S，et al.Enhanced saccharification of sugarcane bagasse using soluble cellulase supplemented with immobilizedβ－glucosidase［J］.Bioresource Technology，2014，167（3）：206－213.

［14］Kurniasih SD，Alfi A，Natalia D，et al.Construction of individual，fused，and co－expressed proteins of endoglucanase andβglucosidase for hydrolyzing sugarcane bagasse［J］.Microbiological Research，2014，169（9／10）：725－732.

［15］路等學，王 龍，張 鐸，等.茶薪菇胞外酶學性質研究［J］.中國釀造，2010，29（2）：37－39.

［16］Xing W，Chen L，Zhang F.Separation of camptothecin from Camptotheca acuminate samples using cloud point extraction［J］.Analytical Methods，2014，6（11）：3644－3650.

［17］Jing L J，LI S Y，Chang Z，et al.Optimization of ultrasoundassisted extraction of camptothecin from Camptotheca acuminata seeds［J］.Journal of Forestry Research，2011，22（2）：239－242.

［18］Fulzele D P，Satdive R K.Comparison of techniques for the extraction of the anti－cancer drug camptothecin from Nothapodytes foetida［J］.Journal of Chromatography A，2005，1063（1／2）：9－13.

［19］Akatin M Y.Characterization of aβ－glucosidase from an edible mushroom，Lycoperdon pyriforme［J］.International Journal of Food Properties，2013，16（7）：1565－1577.