抗菌海洋解淀粉芽孢桿菌GM－1－2菌株搖瓶發酵培養基和發酵條件優化

汪晶晶，曹雪梅，李 歡，暴增海，馬桂珍，賈 杰，王淑芳，羅志會

（1.淮海工學院，江蘇連云港222005；2.江蘇耕耘化學有限公司，江蘇連云港222005）

白色念珠菌（Canidia albicans）是深部真菌感染中最主要的病源真菌，可以感染人體皮膚、黏膜、消化道及其他臟器，是臨床重要的條件致病性真菌［1－2］。近年來，白色念珠菌感染率和對唑類藥物耐藥性逐年增加，而新型藥物的研發較為遲緩，開發新型抗菌化合物為白色念珠菌引發的疾病進行有效治療［3］，是目前亟待解決的問題。

微生物生長過程中能夠產生多種抗真菌和抗細菌的代謝產物，如酶類、脂肽、β－1，3葡聚糖酶及伊枯草菌素等，其中部分代謝物對白色念珠菌具有明顯的抑制作用［4－8］。Wang等從虎杖的根部分離到1株內生鏈霉菌A0916，它對白色念珠菌的抑菌帶寬度達18.3 mm［9］。楊勝遠等從菜園土壤中分離到1株對白色念珠菌具有抑制作用的解淀粉芽孢桿菌K6，它對白色念珠菌的抑菌帶寬度為16.3 mm［10］。馬莉等的研究結果表明，枯草芽孢桿菌LL18－4產生的細菌素對白色念珠菌的抑制帶寬度大于16 mm［11］。王勇勇等從渤海灣分離得到4株對白色念珠菌有抑制作用的真菌，其中BH431菌株發酵液具有較廣泛的酸堿適應范圍及耐高溫特性，具有廣泛的生物活性［12］。張輝等從土壤中篩選出對白色念珠菌具有抑制作用的2株放線菌，并對其中1株放線菌的發酵條件進行優化，得到該菌株的最適發酵時間為96 h，發酵培養基的pH值為7.1，溫度為29℃，轉速為220 r／min，最佳碳源為淀粉，最佳氮源為玉米粉［13］。

海洋芽孢桿菌具有生長繁殖快、代謝周期短、耐受性強、非致病性且能夠產生種類豐富、結構新穎的次級代謝產物等特點，成為工業生產的重要菌質資源，具有廣闊的應用前景［14－16］。GM－1－2菌株是在江蘇省連云港海域海水中分離到的海洋解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GM－1菌株的自發變異菌株，該菌株及其發酵液對白色念珠菌（C.albicans）、小麥根腐病病菌（Bipolaris sorokiniana）、棉花黃萎病病菌（Verticillium dahliae Kleb）、小麥赤霉病病菌（Fusarium graminearum）等多種病原真菌具有明顯的抑制作用（待發表），初步研究結果表明，GM－1－2菌株具有良好的開發應用前景。本試驗以白色念珠菌為指示菌，采用單因素試驗和正交試驗對變異菌株GM－1－2搖瓶發酵的最適培養基成分和發酵條件進行優化，旨在為該菌株的大規模發酵工藝研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

海洋解淀粉芽孢桿菌GM－1－2菌株，由GM－1菌株變異而來，指示菌為白色念珠菌，均由筆者所在實驗室保存。

1.2 培養基

GM－1－2菌株及指示菌菌種活化培養基為PDA培養基，GM－1－2菌株種子液培養基及指示菌培養基為PD培養液。發酵培養基及其配方如表1所示。

1.3 抑菌活性檢測

采用瓊脂擴散法。在PDA平板上涂布100μL培養24 h濃度為106CFU／mL的白色念珠菌菌液，每個涂菌平板上等距離擺放4個牛津杯，每個牛津杯中加入200μL GM－1－2菌株的無菌發酵液（無菌發酵液制備方法參照文獻［17］），以等量的發酵培養基為對照，28℃培養24 h，測定抑菌帶寬度，重復3次。

表1 發酵培養基及其配方

1.4 初始發酵培養基的篩選

選擇9種不同發酵培養基（表1），將濃度為108CFU／mL的GM－1－2菌株種子液按10%的接種量分別接于不同發酵培養基中，于28℃、180 r／min條件下培養60 h，測定發酵液的D600nm和無菌發酵液的抑菌帶寬度，每種發酵培養基3次重復。

1.5 發酵培養基優化的單因素試驗

1.5.1 培養基最佳成分的確定 分別用20 g／L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、半乳糖、果糖、α－乳糖、玉米糊精代替初始發酵培養基中的碳源；加入10 g／L的蛋白胨、豆餅粉、牛肉膏、酵母膏、大豆粉、麥麩作為有機氮源；加入5 g／L氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉作為無機氮源；加入1 g／L磷酸氫二鉀、氯化鈉、碳酸鈣、硫酸鎂，0.1 g／L硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸鉬、硫酸銅作為無機鹽，加入等量的豬肝、番茄、維生素C、低聚果糖、胡蘿卜作為生長因子。以初始發酵培養液為對照，每個處理3次重復，測定發酵液的D600nm和抑菌帶寬度。確定發酵培養基的最佳碳源、氮源、無機鹽和生長因子。

1.5.2 培養基成分最佳濃度的確定 根據篩選的最佳碳源、氮源、無機鹽和生長因子，設定不同濃度配制成不同濃度碳源、氮源和無機鹽培養基進行發酵，測定不同濃度碳源、氮源和無機鹽發酵液的D600nm和抑菌帶寬度。以初始發酵培養液為對照，每個處理3次重復。確定發酵培養基的最佳碳源、氮源、無機鹽和生長因子。

1.6 發酵培養基優化的正交試驗

將篩選得到的最佳碳源、氮源、無機鹽等3個重要的培養基因素按正交試驗 L9（34）設計，pH值為 7.0，在 28℃、180 r／min振蕩培養60 h，以D600nm和抑菌帶寬度為指標考察4因素3水平對發酵水平的影響，確定最佳培養基配方。

1.7 發酵條件的優化

在優化后的發酵培養基基礎上，進行發酵條件的優化。種子液濃度為108CFU／mL時接種量為10%，裝液量為50 mL／250 mL，在28℃條件下，180 r／min振蕩培養 60 h，分別優化發酵時間、初始pH值、培養溫度、轉速、接種量、裝液量，設置不同的梯度，測定發酵液的D600nm和抑菌帶寬度，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 初始發酵培養基篩選結果

由圖1可知，GM－1－2菌株在8號和9號培養基中發酵時，其發酵液菌體密度較高，D600nm分別為 1.228 0、1.221 0，其次是3號和7號培養基，D600nm分別為1.152 0、1.165 0。在8號培養基中發酵液對白色念珠菌的抑制作用最強，抑菌帶寬度達到20.00 mm。因此，選擇8號培養基（PDB培養基）為GM－1－2菌株發酵的初始發酵培養基。

2.2 發酵培養基篩選的單因素試驗結果

2.2.1 碳源種類及濃度篩選結果 由圖2可知，GM－1－2菌株在以葡萄糖為碳源的培養基中發酵時，發酵液菌體密度和抑菌活性最高，D600nm為1.269 0，抑菌帶寬度為20.33 mm，其次是為果糖時，抑菌帶寬度為19.33 mm，D600nm為1.067 0。另外果糖的成本明顯高于葡萄糖，因此選擇葡萄糖作為GM－1－2菌株發酵培養基的最佳碳源。

由圖3可知，不同葡萄糖濃度對GM－1－2菌株的抑菌帶寬度及菌體生長量均有較大影響。當葡萄糖濃度為17.5 g／L時，抑菌帶寬度和 D600nm均達到最高值，分別為20.83 mm、1.225 0。因此，選擇 15.0、17.5、20.0 g／L葡萄糖作為碳源的3個水平進行正交試驗。

2.2.2 氮源種類及濃度篩選結果 由圖4可知，3號、4號、5號有機氮源發酵液的抑菌帶寬度和菌體密度均有所提高，其中，以酵母膏作為氮源的培養基抑菌帶寬度和D600nm均最高，分別為23.50 mm、1.264 0。因此，選擇酵母膏作為GM－1－2菌株發酵的最佳有機氮源。

由圖5可知，GM－1－2菌株在不同酵母膏濃度下的抑菌活性和菌體生長量均有明顯變化。當酵母膏濃度為2.5～10.0 g／L時，抑菌帶寬度、D600nm均明顯上升。當酵母膏濃度為10.0 g／L時，抑菌帶寬度、D600nm均達到最高值，分別為23.43 mm、1.279 0。當酵母膏濃度高于 10.0 g／L時，抑菌帶寬度、D600nm均逐漸下降。因此，選擇 7.5、10.0、12.5 g／L酵母膏作為氮源的3個水平進行正交試驗。

2.2.3 無機鹽種類及濃度篩選結果 由圖6可知，無機鹽種類不同對海洋解淀粉芽孢桿菌GM－1－2菌株抑菌活性和菌體密度的影響均較為明顯。含有硫酸亞鐵發酵液的抑菌帶寬度、D600nm均最高，分別達到 21.67 mm、1.275 0，其次是含有磷酸氫二鉀發酵液的抑菌帶寬度，為19.73 mm。結果表明，在培養基中添加硫酸亞鐵有利于GM－1－2菌株的生長和抑菌物質的產生。

由圖7可知，當硫酸亞鐵的濃度為0.12 g／L時，抑菌帶寬度、D600nm均較高，抑菌帶寬度為 22.23 mm，D600nm為1.296 5，當硫酸亞鐵的濃度為0.10、0.14 g／L時次之。因此，選擇 0.10、0.12、0.14 g／L硫酸亞鐵作為氮源的 3個水平進行正交試驗。

2.2.4 生長因子種類及濃度篩選結果 由圖 8可知，GM－1－2菌株發酵液中加入不同生長因子時，對其抗菌活性及菌體生長量均無明顯的促進作用。因此，正交試驗中不加入生長因子。

2.3 海洋解淀粉芽孢桿菌GM－1－2菌株培養基優化的正交試驗結果

由表2可知，6號組合培養基的抑菌帶寬度、D600nm均達到最高值，抑菌帶寬度為 26.67 mm，D600nm為 1.276 0，與其他培養基差異顯著。因此，選擇6號組合作為GM－1－2菌株液體發酵培養基，其配方為200.00 g／L馬鈴薯、17.50 g／L葡萄糖、12.50 g／L酵母膏、0.12 g／L硫酸亞鐵，1 000 mL水。

表2 海洋解淀粉芽孢桿菌GM－1－2菌株培養基發酵液優化的正交試驗結果

2.4 菌株GM－1－2發酵條件篩選結果

2.4.1 菌株GM－1－2發酵時間優化 由圖9可知，菌株GM－1－2在0～22 h內菌體密度逐漸上升，同時菌株開始產生抑菌物質；22～32 h菌株GM－1－2的菌體生長平穩，進入穩定期。30 h時抑菌帶寬度、D600nm均達到最大值，分別為38.00 mm、1.542 0；32 h后進入衰亡期，發酵液菌體密度逐漸下降，抑菌帶寬度逐漸減小。因此，菌株GM－1－2的最佳發酵時間為30 h。

2.4.2 GM－1－2菌株發酵初始pH值優化 由圖10可知，不同初始pH值發酵液對GM－1－2菌株的抑菌活性影響較大。當初始pH值為5～7時，抑菌帶寬度、D600nm均明顯上升；當初始pH值為7時，抑菌帶寬度、D600nm均達到最大值，分別為37.67 mm、1.566 0；當初始 pH值為7～10時，抑菌帶寬度、D600nm均逐漸下降。因此，GM－1－2菌株發酵的最佳初始pH值為7。

2.4.3 GM－1－2菌株發酵搖床轉速優化 由圖11可知，當轉速為180、200 r／min時，GM－1－2菌株的菌體密度較高，其 D600nm分別為 1.527 7、1.510 7。且轉速為 180 r／min時，GM－1－2菌株的抑菌帶寬度達到最大值，為37.67 mm。因此，選擇180 r／min作為GM－1－2菌株發酵的最佳轉速。

2.4.4 GM－1－2菌株發酵接種量優化 由圖12可知，當接種量為10%時，菌株GM－1－2的抑菌帶寬度、菌體密度均達到最大值，此時抑菌帶寬度為 37.67 mm，D600nm為1.526 7。因此，選擇接種量為10%作為GM－1－2菌株的最佳接種量。

2.4.5 GM－1－2菌株發酵溫度優化 由圖13可知，當發酵溫度為28℃時，GM－1－2菌株的抑菌活性和菌體密度均達到最大值，此時抑菌帶寬度為38.0 mm，D600nm為1.560 0。因此，選擇28℃作為GM－1－2菌株發酵的最佳溫度。

2.4.6 GM－1－2菌株發酵裝液量優化 由圖14可知，當裝液量為60 mL（250 mL三角瓶）時，D600nm達到 1.672 7，抑菌帶寬度為38.0 mm，均為最大值，此時最適合GM－1－2菌株抑菌活性物質的產生與菌體的生長。因此，選擇裝液量為60 mL（250 mL三角瓶）作為GM－1－2菌株的最佳裝液量。

3 討論與結論

搖瓶發酵培養過程中，GM－1－2菌株發酵液的抑菌作用隨著其菌體生長量的增加而增強，表明GM－1－2菌株產生的抑菌物質來源于產能的初級代謝，屬于生長相關型代謝產物。因此，在后期工業生產大規模發酵研究中，可采用補料發酵的方式，進一步提高GM－1－2菌株的菌體生長量和抑菌物質產量。

本研究通過單因素試驗和正交設計試驗，對海洋解淀粉芽孢桿菌GM－1－2菌株發酵培養基及其發酵條件進行優化，結果表明，GM－1－2菌株搖瓶發酵的最佳培養基配方為17.50 g／L葡萄糖、12.50 g／L酵母膏、0.12 g／L硫酸亞鐵、200.00 g馬鈴薯、1 000 mL水。最佳發酵條件：28℃恒溫培養，初始pH值為7，180 r／min搖床培養30 h，裝液量為60 mL（250 mL三角瓶），種子液濃度為108CFU／mL時接種量為10%。菌株GM－1－2在培養基及發酵條件優化后的菌體生長量和抑菌帶寬度均有明顯提高，D600nm由1.228 0增加到1.672 7，抑菌帶寬度由 20.00 mm增加到 38.67 mm，比優化前抑菌帶寬度提高93.3%。本試驗的結果可以為菌株GM－1－2的進一步開發應用提供理論基礎。

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