餐廚垃圾中膠原蛋白和幾丁質原位降解菌株的篩選與鑒定

李 蕓，王李忻，葛夢嬌，尹軍霞，陳夢娜

（紹興文理學院生命科學學院，浙江紹興312000）

隨著人民生活水平提高、飲食習慣和能源結構的改變，餐廚垃圾在生活垃圾中所占的比例逐年升高，近年我國每天產生的餐廚垃圾約占生活垃圾的50%［1］。目前，城市餐廚垃圾的主要處理方法是生產飼料或者有機肥料，但餐廚垃圾來源分散，收集和運輸都很麻煩，而且餐廚垃圾還容易腐敗發臭［2－3］，且多數農村沒有餐廚垃圾全面的收運和處理系統，大部分的餐廚垃圾直接喂生豬和畜禽，一部分被直接排入就近水系或土壤，或者隨同其他生活垃圾一起被填埋處理，嚴重污染了環境［4］。因此將餐廚垃圾就地產生就地消納的原位消除技術，是實現餐廚垃圾無害化、減量化和資源化的有效途徑［1，5－6］。能針對性地降解餐廚垃圾主要成分的微生物菌劑是原位消除技術的關鍵。國內外許多學者圍繞著降解餐廚垃圾中的淀粉、纖維素、蛋白質、脂類四大類有機物，篩選到了許多原位降解菌株［1－3，6－7］。然而，常見飲食中的雞爪、雞翅、豬蹄、魚皮、肉皮等還會產生含膠原蛋白的餐廚垃圾；水鄉或沿海地區餐廚垃圾中蝦殼、蟹殼的主要成分是幾丁質。針對餐廚垃圾中膠原蛋白和幾丁質降解菌的篩選，目前國內外還未見報道。本研究擬篩選能同時降解膠原蛋白和幾丁質的降解菌，為餐廚垃圾原位消除技術奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品

從浙江省紹興市周邊農村收集的餐廚垃圾（蟹殼、蝦殼、豬蹄、雞爪、雞皮等殘渣）以及從畜肉市場、屠宰場等處采集的土樣、水樣。

1.2 培養基配制

富集培養基：明膠 1 g／mL，幾丁質 5 g／mL，NaCl 5 g／mL，蛋白胨5 g／mL，pH值7.2～7.4。

初篩培養基 1：明膠 20 g／mL，NaCl 0.1 g／mL，蛋白胨5 g／mL，KH2PO40.5 g／mL，MgSO40.2 g／mL，瓊脂 20 g／mL，pH值7.2～7.4。

種子培養基：牛肉膏 5 g／mL，NaCl 5 g／mL，蛋白胨10 g／mL，pH值 7.2～7.4。

初篩培養基 2：（NH4）2·SO45 g／mL，KH2PO41 g／mL，MgSO40.25 g／mL，酵母粉 2 g／mL，幾丁質 10 g／mL，瓊脂20 g／mL，pH值 7.0～7.4。

產幾丁質酶培養液：幾丁質 5.0 g／mL，蛋白胨 5.0 g／mL，酵母粉 2.5 g／mL，NaCl5.0 g／mL，pH值 7.0。

復篩培養基：幾丁質 5 g／mL，蛋白胨 3 g／mL，KH2PO40.3 g／mL，K2HPO40.7 g／mL，MgSO40.5 g／mL，NaCl 5.0 g／mL，pH值 7.0～7.4。

1.3 富集培養

取2 g土樣、2mL水樣或2mL餐廚垃圾水洗樣接種到富集培養基中，37℃、150 r／min搖瓶培養2 d。

1.4 膠原蛋白降解菌的平板初篩和豬皮消化試驗

將富集培養液梯度稀釋液涂布初篩平板1（初篩培養基1制作的平板）中，37℃培養24 h，按吳琦等的方法［8］平板初篩膠原蛋白降解菌。分別挑取初篩菌株1環，接種于種子培養基中，37℃培養2 d，4 000 r／min離心10 min，取上清液，按吳琦等的方法［8］檢測上清液消化新鮮豬皮的效果。

1.5 幾丁質降解菌的平板初篩和蝦殼消化試驗

取消化豬皮效果明顯的菌株點種于初篩平板2（初篩培養基2制作的平板）中，37℃培養48 h，取水解圈直徑與菌落直徑比值較大者進行復篩［9］。挑取幾丁質降解菌接種于產幾丁質酶培養液中，37℃培養2 d后，4 000 r／min離心10 min。將大小質量基本相同的蝦殼洗凈晾干，分別裝入試管后滅菌，每管加入上清液各10 mL，蓋上棉塞，室溫放置4 d。另取1管加入10 mL無菌培養液作為對照。

1.6 酶活測定

取消化蝦殼效果明顯的菌株1環，接種于種子培養基中，37℃、150 r／min培養24 h，再按5%的接種量接種到復篩培養基中，37℃、150 r／min培養48 h。發酵液5 000 r／min離心10 min后，取上清液測定膠原蛋白酶和幾丁質酶的活性。

膠原蛋白酶活力測定采用茚三酮顯色法［8］，以Ⅲ型膠原蛋白（購自SIGMA公司）作為底物，測定反應所釋放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸顯色制定標準曲線。在37℃、pH值7.5條件下，1 mL酶液1 min水解膠原蛋白產生相當于1μmol甘氨酸的酶量為1個酶活力單位（U）。

幾丁質酶活性測定采用DNS法［9］，1個酶活力單位定義：1 h釋放出相當于100μg N－乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。

1.7 菌種鑒定

菌種形態和生理生化鑒定參照《常見細菌系統鑒定手冊》［10］；16S rDNA測序參照喬長晟等的方法［2］。

1.8 餐廚垃圾的原位降解

從紹興周邊收集餐廚垃圾，挑出垃圾中雞皮、雞爪、雞翅、蝦殼、蟹殼等殘渣裝入桶里，每桶裝樣量為0.5 kg，再按10%的接種量接入選定菌的種子培養液，室外（溫度15～25℃）放置48 h，處理前和處理后測定有機質含量（重鉻酸鉀法），計算降解率。每組3個平行，以接種10%的無菌種子培養液作對照。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白降解菌的平板初篩及豬皮消化試驗

篩選到18株消化豬皮效果明顯的膠原蛋白降解菌，其中A1、A2、A5、A6、A7、B1、B2、B3、B4、B7、C3等 11株菌消化后的豬皮體積不足對照的1／3（圖1），為高效降解膠原蛋白的菌株。

2.2 幾丁質降解菌的平板初篩及蝦殼消化試驗

11株高效降解膠原蛋白的菌株中，B3和C3在含幾丁質的平板上產生了明顯的透明圈（圖2），說明B3和C3能夠降解幾丁質。B3和C3都能消化蝦殼，其中B3將蝦殼完全消化成了沙粒大小的碎渣，消化液也因此變得渾濁（圖3），表明B3降解蝦殼的幾丁質酶活性很高。

2.3 復篩

B3的膠原蛋白酶活性和C3差異不顯著，而幾丁質酶活性顯著比C3高（表1）。選取B3作為目標菌進行鑒定。

表1 2株菌酶活性測定結果

2.4 菌種的鑒定

2.4.1 形態鑒定 B3在酪氨酸培養基上菌落呈白色，不透明，圓形，邊緣不整齊。革蘭氏染色陽性結果見圖4。

2.4.2 生理生化鑒定 B3的常見生理生化特征見表2。

2.4.3 16S rDNA測序 B3的16S rDNA PCR擴增產物片段經寶生物工程（大連）有限公司測序，確定片段長度為1 463 bp（GenBank登陸號：KP716831），經過 GenBank核酸數據BLAST分析和 ClustalX 1.8.1比對，使用 MEGA4按Neighbor－Joining法構建系統發育樹（圖5）。B3與Bacillus subtilis和Bacillus atrophaeus的序列相似性都達99%以上，結合形態（特別是在酪氨酸培養基上菌落無明顯黑色素產生）和生理生化特征，B3被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表2 B3生理生化特征

2.5 餐廚垃圾的原位降解

B3原位降解富含膠原蛋白和幾丁質的餐廚垃圾2 d后，垃圾中的有機質含量與對照相比，顯著降低，降解效果達到24.78%，比對照高 174%（表3）。

表3 B3原位降解餐廚垃圾的效果

3 討論

餐廚垃圾的微生物原位降解技術，利用微生物在餐廚垃圾的源頭進行減量和消納，不僅可以降低生活垃圾社區和市政收集、運輸和處理的難度，還可以制造有機肥料就地用于陽臺花園的種植，是餐廚垃圾綠色環保處理方式［11－12］。水鄉或沿海地區的餐廚垃圾富含膠原蛋白和幾丁質，原位降解這類餐廚垃圾時，高效降解膠原蛋白和幾丁質的微生物是關鍵。國內外一些學者從富含膠原蛋白的環境中篩選到了能降解膠原蛋白的微生物［13－14］，也有很多學者從幾丁質的環境中篩選到了降解幾丁質的菌種［9，15－16］。本研究首次從餐廚垃圾中分離到了1株既能降解膠原蛋白又能降解幾丁質的菌株，該菌室外原位降解富含膠原蛋白和幾丁質的餐廚垃圾2 d的降解效果達到24.78%。而且，該菌淀粉水解陽性，如應用在餐廚垃圾的原位降解上，將能發揮同時降解膠原蛋白、幾丁質、淀粉的三重功效，具有非常廣闊的應用前景。

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