黑斑蛙“白內(nèi)障（歪頭）”病原診斷及藥敏試驗(yàn)

夏理海，羅 凱，李由申，韓盼盼，黎 明，郜衛(wèi)華，許巧情，2，胡 偉，2

（1.長(zhǎng)江大學(xué)濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州434025；2.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）為革蘭氏陰性菌，隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）克雷伯菌屬（Klebsiella），由Friendiander于1893年從患大葉性肺炎病人的肺組織中首次分離到［1］。該細(xì)菌廣泛分布于自然界，近年來成為僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌［2－4］。該菌最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適 pH值為 7.0～7.6［1］。肺炎克雷伯菌可在全身各部位發(fā)生感染，可引起肺炎、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎等，且發(fā)病死亡率極高［5］。

黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）俗稱田雞、青蛙，屬蛙科側(cè)褶蛙屬的兩棲動(dòng)物，廣泛分布于我國(guó)各地區(qū)（除海南、云南、臺(tái)灣地區(qū)）［6］。野生黑斑蛙為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，以稻田、水塘等水域?yàn)榉敝成婧筒妒郴顒?dòng)的主要場(chǎng)所［7］。目前，我國(guó)黑斑蛙人工養(yǎng)殖處于起步階段，屬于朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，市場(chǎng)前景廣闊［8］。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、集約化程度的不斷提高，其疾病也頻繁發(fā)生。已有報(bào)道稱，藤黃葡萄球菌、淺黃假單胞菌和氣單胞菌可引起牛蛙的歪頭病和白內(nèi)障病［9－10］，布氏檸檬酸桿菌和腦膜炎敗血金黃桿菌可引起棘胸蛙的白內(nèi)障病和歪頭病［11－12］，腦膜炎敗血黃桿菌可引起虎紋蛙的白內(nèi)障病［13］，金黃色葡萄球菌可引起棘腹蛙的白內(nèi)障病等［14］。但是，對(duì)黑斑蛙相關(guān)疾病的研究少見報(bào)道。本研究采用16S rRNA基因同源性分析法和系統(tǒng)發(fā)育樹分析法對(duì)湖北松滋鑫滿塘生態(tài)養(yǎng)殖公司發(fā)病黑斑蛙進(jìn)行病原菌分離、鑒定，旨在為該病的確診和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病蛙的來源

患病黑斑蛙于2016年9月15日從湖北松滋鑫滿塘生態(tài)養(yǎng)殖公司稻、鰍、蛙連作基地取回，體質(zhì)量為 100～150 g／只。

1.2 主要試劑

牛肉膏蛋白胨肉湯培養(yǎng)基（LB）、諾氟沙星、多粘菌素B、頭孢曲松、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、丁胺卡納等10種抗菌藥物藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物有限公司；dNTP（2.5 mmol／L）、Easy Taq酶（5 U／μL）、10×Easy Taq Buffer（1.2mL），均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

取典型白內(nèi)障病黑斑蛙，在無(wú)菌環(huán)境中分別從其皮膚、眼、肝、肺、胃、腸和心取材，并置于 1.5 mL EP管中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，用組織勻漿機(jī)將樣品攪碎，1 200 r／min短暫離心取上清進(jìn)行LB培養(yǎng)基平板劃線分離，37℃、200 r／min培養(yǎng)12～24 h，挑選單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)和鑒定。

1.4 病原菌16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

在無(wú)菌環(huán)境下，挑取單克隆到1.5 mL EP管中并加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、200 r／min培養(yǎng)12～24 h，待菌液渾濁后于1 200 r／min短暫離心棄上清，以16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系采用25μL的反應(yīng)體系，其擴(kuò)增程序如下：95℃10 min；95℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后交由武漢擎科生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序得到的16S rRNA基因序列與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行Blast分析，選取同源性較高的序列在MEGA 5.1軟件上完成序列的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 病原菌的特異性檢測(cè)

病原菌測(cè)序得到的16S rRNA基因序列與GenBank中已知核酸序列進(jìn)行Blast分析后，使用特異性引物khe對(duì)其進(jìn)行特異性檢測(cè)和驗(yàn)證。

1.6 藥敏試驗(yàn)

測(cè)序鑒定后，吸取適量菌液均勻地涂布于LB培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌鑷子取待測(cè)藥敏紙片（直徑6 mm），將其緊貼于LB培養(yǎng)基表面，并將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑（mm）［15］。

1.7 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

16SRNA細(xì)菌引物序列由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所提供，特異引物khe參照艾克特等的方法［16］進(jìn)行設(shè)計(jì)，均由擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 黑斑蛙白內(nèi)障病的主要癥狀

白內(nèi)障病是目前黑斑蛙養(yǎng)殖過程中常見的流行病，病蛙厭食懶動(dòng)，應(yīng)急能力差，身體失去平衡，游動(dòng)時(shí)身體打轉(zhuǎn)，最明顯的癥狀為眼球發(fā)白，頭部歪曲。此外經(jīng)解剖后，由圖1可知，病蛙出現(xiàn)肝花白或充血，肺腫大等病變。

2.2 16S rRNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

PCR擴(kuò)增分離細(xì)菌的16S rRNA基因，得到的片段長(zhǎng)度約為1 400 bp，與預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物的大小一致，電泳結(jié)果見圖2。PCR產(chǎn)物經(jīng)武漢擎科生物公司測(cè)序后，用Blast對(duì)分離細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，分離菌株與肺炎克雷伯菌相似性為99%。選取同源性較高的菌株，以維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）作為外類群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。這些細(xì)菌聚為3組，1組是肺炎克雷伯菌，1組是產(chǎn)酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca），1組是維氏氣單胞菌。分離的菌株與肺炎克雷伯菌處于同一分支上，親緣關(guān)系最近，命名為9HeiBan Frog Heart。經(jīng)16S rRNA測(cè)序與系統(tǒng)聚類鑒定表明，該病原菌為肺炎克雷伯菌屬，使用肺炎克雷伯菌特異引物khe對(duì)其進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到片段大小為475 bp，與目標(biāo)產(chǎn)物大小一致，電泳結(jié)果見圖4，進(jìn)一步確定該菌株為肺炎克雷伯菌。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用10種水產(chǎn)常用抗菌藥物的藥敏紙片做敏感性試驗(yàn)，表2結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌對(duì)諾氟沙星、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星及丁胺卡納等5種藥物敏感；對(duì)多黏菌素B和四環(huán)素等2種藥物中度敏感；對(duì)萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明及多西環(huán)素3種藥物耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 黑斑蛙“白內(nèi)障（歪頭）”病的命名

黑斑蛙“白內(nèi)障（歪頭）”病是以患病黑斑蛙眼球發(fā)白、頭向一側(cè)歪斜這一明顯癥狀而命名的，如已報(bào)道的牛蛙“白內(nèi)障”病［10］、棘胸蛙“白內(nèi)障”病［11］、虎紋蛙“白內(nèi)障”病［13］、牛蛙“歪頭”病［9］、牛蛙“腹水”病［17］等均是細(xì)菌性疾病，同樣，在養(yǎng)殖魚類中也存在“白內(nèi)障”這一說法，但魚類“白內(nèi)障”病卻是由寄生引起的［18］。雖然致病病原不一樣，但均有某一明顯癥狀，研究者以該癥狀對(duì)其進(jìn)行命名。故此，本研究也以同樣的方法將黑斑蛙所患疾病命名為“白內(nèi)障（歪頭）”病。

3.2 肺炎克雷伯菌對(duì)黑斑蛙的影響

肺炎克雷伯菌為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，廣泛存在于水和土壤等微生態(tài)環(huán)境中，可感染全身各部［19］。本研究從病蛙多部位分離細(xì)菌經(jīng)測(cè)序分析為同一種細(xì)菌——肺炎克雷伯菌。根據(jù)患病黑斑蛙的外觀癥狀及測(cè)序結(jié)果可知，肺炎克雷伯菌對(duì)黑斑蛙的感染是多部位的，并非局部感染，產(chǎn)生的病癥也多樣化。同時(shí)，該病菌對(duì)水生動(dòng)物健康和實(shí)踐生產(chǎn)的危害也是巨大的。

3.3 病原菌的耐藥性

目前，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病大多仍采用抗菌藥物來控制其發(fā)生和流行［20］，由于肺炎克雷伯菌流行廣泛，人們大量使用抗生素造成肺炎克雷伯菌耐藥性普遍存在［1］。本研究以10種常用抗菌藥物對(duì)從患病黑斑蛙各組織分離培養(yǎng)出來的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌對(duì)諾氟沙星、頭孢曲松、氧氟沙星、環(huán)丙沙星及丁胺卡納等5種藥物敏感；對(duì)多黏菌素B和四環(huán)素等2種藥物中度敏感；對(duì)萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明及多西環(huán)素3種藥物耐藥。該結(jié)果與周蓉等的結(jié)果［21－22］差異較大。由于肺炎克雷伯菌臨床分離的菌株數(shù)量繁多，可能是由于分離的菌株之間存在差異而造成的，還可能與細(xì)菌的來源和區(qū)域及感染對(duì)象的分布不同有關(guān)。因此，用藥時(shí)應(yīng)在相應(yīng)病原菌藥敏測(cè)定后，有針對(duì)性地選擇藥物用于黑斑蛙的養(yǎng)殖生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］賈 艷，孫長(zhǎng)江，韓文瑜，等.肺炎克雷伯菌研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2006，26（5）：75－78.

［2］Ronald A.The etiology of urinary tract infection：traditional and emerging pathogens［J］.Dis Mon：DM，2003，49（2）：71－82.

［3］Craven D E.What is healthcare－associated pneumonia，and how should it be treated？［J］.Current Opinion in Infectious Diseases，2006，19（2）：153－160.

［4］Gupta A.Hospital－acquired infections in the neonatal intensive care unit－Klebisiella pneumonia［J］.Seminars in Perinatology，2002，26（5）：340－345.

［5］Hooi S H，Hooi S T.Culture－proven bacterial keratitis in a Malaysian general hospital［J］.The Medical Journal of Malaysia，2005，60（5）：614－623.

［6］郭 靜，侯國(guó)賓，孟慶雄，等.黑斑側(cè)褶蛙抗菌肽Pelophylaxin 2PG的cDNA篩選與性質(zhì)研究［J］.昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，37（3）：64－68.

［7］王丹丹，趙爾宓.阿維菌素對(duì)黑斑側(cè)褶蛙毒理效應(yīng)的研究［J］.四川動(dòng)物，2013，32（3）：334－342.

［8］楊尚昆，陳金輝，潘麗婷，等.黑斑蛙高效生態(tài)養(yǎng)殖新型技術(shù)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（29）：52－53.

［9］楊春浩.牛蛙歪頭病病原、病理及敏感藥物研究［D］.長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［10］紀(jì)榮興，鄒文政，莫英軍.牛蛙“白內(nèi)障”病病原的初步研究［J］.集美大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，8（1）：8－11.

［11］程曉云，鄭芊芷，宋婷婷，等.棘胸蛙白內(nèi)障病原鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（7）：1141－1151.

［12］李 明，宋婷婷，鄭榮泉，等.棘胸蛙歪頭病病原分離·鑒定與藥敏試驗(yàn)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（3）：64－66.

［13］周永燦，朱傳華，陳國(guó)華，等.虎紋蛙白內(nèi)障病病原的分離鑒定及其免疫防治［J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，10（1）：16－21.

［14］廖冰潔，樊汶樵，周 莉，等.一例棘腹蛙“白內(nèi)障”的病原分離鑒定［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2014，35（8）：8－10，11.

［15］沈文英，李衛(wèi)芬，高 研.中華鱉病原性維隆氣單胞菌的分離及藥敏試驗(yàn)［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2010，34（5）：1060－1064.

［16］艾克特，徐 佩，周靜文，等.5種淡水細(xì)菌的多重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2015，34（5）：321－326.

［17］于 ?，肖克宇，鐘 蕾，等.牛蛙腹水病病原鑒定和藥敏試驗(yàn)［J］.淡水漁業(yè)，2013，43（1）：50－54.

［18］葉尚明，張人銘，高愛劉，等.扁吻魚雙穴吸蟲病的防治［J］.中國(guó)水產(chǎn)，2004（12）：52－53.

［19］周 蓉，朱衛(wèi)民.肺炎克雷伯菌分子流行病學(xué)及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè)，2012，33（1）：1－5，42.

［20］夏 飛，梁利國(guó)，謝 駿.異育銀鯽病原維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.淡水漁業(yè)，2012，42（5）：22－26.

［21］周 蓉，朱衛(wèi)民，黃文祥，等.855株肺炎克雷伯菌感染的臨床分布及耐藥性分析［J］.中國(guó)抗生素雜志，2013，38（5）：363－369.

［22］劉衛(wèi)國(guó).肺炎克雷伯菌臨床分布及耐藥性分析［J］.實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2011，27（3）：192－193.