hMTERF3基因在卵巢癌組織的表達及其對預后的影響＊

熊 偉，楊勇琴，李 彬，梅 雯，嚴長寶，戴莉萍，余 敏

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而居第三位，但卵巢癌病死率居各類婦科惡性腫瘤的首位，5年生存率不足30%，嚴重威脅女性健康和生命［1］。卵巢癌早期癥狀隱匿，常在癥狀出現(xiàn)之前已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者就診時已處于晚期［1］。卵巢癌的臨床治療以手術(shù)為主，化療為輔，并配合放療、生物學治療等手段［2］。近年來，隨著醫(yī)學分子生物學理論和技術(shù)的發(fā)展，卵巢癌的基因治療成為大家關(guān)注的焦點，并在臨床上取得了較好的療效，具有較好的應(yīng)用前景。

人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3（human mitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3），也稱為線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1（human mitochondrial transcription termination factor domain containing 1，hMTERFD1），是由417個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)［3］。在人、大鼠、小鼠等7個不同的物種中進行氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)包含5個保守的MTERF基序，含有3個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，是MTERF蛋白家族進化最保守的成員［4］。動物實驗表明，敲除MTERF3基因的小鼠線粒體DNA拷貝數(shù)上升，MTERF3通過結(jié)合線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）啟動子區(qū)而抑制線粒體基因表達過程，缺失MTERF3的細胞線粒體DNA兩條鏈的轉(zhuǎn)錄起始活性均有增加，證明核基因編碼的MTERF3是一種轉(zhuǎn)錄負性調(diào)控因子［5］。 Park 等［5］研究表明，哺乳動物MTERF3顯著抑制mtDNA的表達，通過減少呼吸鏈復合體蛋白亞基的產(chǎn)生而降低氧化磷酸化水平，從而減少細胞內(nèi) ATP 的合成［5，6］。但目前為止，關(guān)于hMTERF3在卵巢癌中研究的尚未見報道。

利用基因芯片或者轉(zhuǎn)錄組分析為代表的高通量測序技術(shù)目前已經(jīng)成為惡性腫瘤研究的強大工具，然而由于測序平臺、樣本數(shù)量以及分析方法的不同，常導致實驗結(jié)果有偏差，結(jié)果分析比較片面。如何有效利用上述資源是當前科研人員面臨的重大問題。數(shù)據(jù)挖掘及整合分析可以聯(lián)合運用多種數(shù)據(jù)消除以上因素的影響，從整體的角度來理解這些數(shù)據(jù)。目前，生物數(shù)據(jù)整合分析逐漸成為大數(shù)據(jù)挖掘的重要方向，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種類型的惡性腫瘤分析中。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是大型的腫瘤基因芯片整合數(shù)據(jù)庫，最新數(shù)據(jù)涵蓋已知所有的癌癥類型，包含715個數(shù)據(jù)集，共計86 733個癌組織及正常組織數(shù)據(jù)。利用Oncomine可以進行腫瘤組織及其相應(yīng)的正常組織中的mRNA表達差異分析，可以尋找潛在感興趣的基因，其整合的大量數(shù)據(jù)保證分析結(jié)果具有極其重要的參考價值，也可以發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤生物標志物和腫瘤基因治療靶點。該研究擬通過對Oncomine基因芯片和臨床實驗檢測數(shù)據(jù)的整合分析，比較分析hMTERF3基因在正常卵巢上皮組織與卵巢癌組織中表達水平，并探討其表達水平與卵巢癌患者預后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中挖掘數(shù)據(jù)Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫是一個基于基因芯片研究的數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)研究的需要進行數(shù)據(jù)篩選和挖掘的條件設(shè)定。該研究中，筆者設(shè)定的數(shù)據(jù)篩選條件為：（1）“Gene：MTERFD1”；（2） “Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”；（3）“Cancer Type：Ovarian Cancer”；（4）“Date Type：mRNA”；（5）“Simple Type：Clinical Specimen”；（6）臨界值設(shè)定條件 （P value＜1×10-4，fold change=2，gene rank=top 10%）。數(shù)據(jù)輸出另存為Excel表格。

1.2 Western blot檢測hMTERF3蛋白在卵巢癌和正常卵巢上皮組織中的表達選取2016年—2017年大理白族自治州第一人民醫(yī)院病理科收集的30例卵巢癌組織及其對應(yīng)的正常卵巢上皮組織，提取30對配對卵巢癌和正常卵巢上皮組織總蛋白，采用BCA法測定各組樣本蛋白質(zhì)的濃度。各取50 μg蛋白質(zhì)上樣，用SDS-PAGE凝膠電泳儀系統(tǒng)電泳分離總蛋白質(zhì)，采用Trans-BlotTurboTM將蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)印（15 V，7 min）至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h，加入兔抗人MTERFD1多克隆抗體 （1∶1000稀釋）4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，同時檢測GAPDH蛋白的表達水平作為內(nèi)參照；TBST液洗滌3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗 （1∶5000稀釋）4℃孵育2 h，TBST洗滌3次，5 min/次。將超敏型ECL顯影液滴于PVDF膜條上，用ChemiDocTMXRS+超靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯色曝光，掃描成圖像。蛋白質(zhì)條帶用Image LabTM5.2.1軟件進行灰度值的計算，以MTERF3/GAPDH的比值表示MTERF3蛋白的相對表達水平，實驗至少重復3次。

1.3 Kaplan-Meier Plotter進行患者生存周期分析利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）的卵巢癌數(shù)據(jù)集對hMTERFD1進行分析，得到相應(yīng)的Kaplan-Meier生存曲線、風險比（Hazard ratio，HR）及 Log rank P（P value）值。探針選擇為 JetSet，所需的有效Affymetrix ID：219363_s_at（MTERFD1）。首先根據(jù)人MTERFD1 mRNA表達水平分為高表達組和低表達組，截尾數(shù)據(jù)為腫瘤無進展生存期 （progression free survival，PFS）。符合條件的總病例數(shù)為1436例，分析人MTERFD1表達水平與卵巢癌患者預后的關(guān)系。然后，設(shè)定截尾數(shù)據(jù)為總體生存期 （overall survival，OS），符合條件總病例數(shù)為1657例，分析人MTERFD1表達水平與卵巢癌患者預后的關(guān)系。篩選條件如下：（1）“Cancer type：Ovarian Cancer”；（2）“Gene：MTERFD1”；（3）“Survival：OS or PFS”。

1.4 hMTERF3在不同分期卵巢癌中的預后作用

分別設(shè)截尾數(shù)據(jù)為PFS和OS，然后探針選擇為JetSet， 所 需 的 有 效 Affymetrix ID：219363_s_at（MTERFD1），在Stage選項下面分別選擇1期、1+2期、2期、2+3期、2+3+4期、3期、3+4期、4期， 分別在線分析人MTERFD1在不同腫瘤分期的卵巢癌患者中的預后作用。

1.5 統(tǒng)計學分析正常對照組和卵巢癌患者病例組之間hMTERF3表達的差異采用t檢驗。所用統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0軟件進行，以雙側(cè)P＜0.05為有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 hMTERF3在所有腫瘤類型中的表達Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫中共收集了756個不同類型的研究結(jié)果，其中關(guān)于hMTERF3表達有統(tǒng)計學差異的研究結(jié)果共104個，hMTERF3表達增高的研究有76個，hMTERF3表達降低的研究有28個 （表1）。在婦科常見的惡性腫瘤中，乳腺癌中高表達的研究有12個，低表達的有5個；子宮頸癌中高表達的研究有2個，低表達的研究有0個；卵巢癌中高表達的研究有1個，低表達的研究有2個。

2.2 hMTERF3在卵巢癌中的表達在Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫中，從2004年開始至今，共有11項研究涉及hMTERF3在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達，共包括995個樣本（圖1）。文章分別發(fā)表 于 Cancer Research［7，8］、Clinic Cancer Research［9］及 Cancer Science［10］。 薈萃 11 個研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，hMTERF3在卵巢癌中高表達，其中位數(shù)值為3781.0，P=0.020，表明其高表達具有顯著性差異。

表1 hMTERF3在Oncomine數(shù)據(jù)庫中所有人類腫瘤相關(guān)研究中的表達

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因在卵巢癌中的表達

2.3 在不同研究中卵巢癌組織與正常卵巢組織hMTERF3的表達差異在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，筆者獲取4個不同研究的基因芯片數(shù)據(jù)，作箱圖比較分析，在所有研究的結(jié)果中，與正常卵巢組織相比，hMTERF3 mRNA在卵巢癌中的表達量均顯著增高（P＜0.05）（圖 2）。

2.4 卵巢癌組織與正常卵巢上皮組織hMTERF3蛋白的表達通過Western blot檢測30例配對卵巢癌與正常卵巢上皮組織中hMTERF3蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，28例 （93.33%）卵巢癌組織中hMTERF3蛋白表達水平較正常卵巢上皮組織顯著增高 （P＜0.05），而在2例卵巢癌組織中hMTERF3蛋白表達水平增高不顯著（P＞0.05）（圖 3）。

2.5 hMTERF3表達量與卵巢癌預后的關(guān)系為進一步明確hMTERF3基因表達量與卵巢癌患者預后的關(guān)系，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行生存分析、風險比和Log-Rank檢驗。當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者PFS，經(jīng)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，HR=1.21，log-rank P 值為0.0027。當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者OS，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，得到了相似的結(jié)果，HR=1.22，log-rank P值為0.0028。以上結(jié)果提示，hMTERF3 mRNA的表達水平是卵巢癌患者預后的危險因素（HR＞1），其表達水平越高，患者的預后越差（圖 4）。

2.6 各個分期卵巢癌患者的預后與hMTERF3 mRNA水平的關(guān)系截尾數(shù)據(jù)為PFS時，早期卵巢癌患者（1期、1+2期或2期）中hMTERF3表達水平越高，患者預后越差（HR＞1）。其中在1+2期卵巢癌患者中HR值為2.43，表明越早期的卵巢癌患者，hMTERF3表達水平的預后價值越大。將截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS，得出了相似的結(jié)果（表2）。認為早期卵巢癌患者中hMTERF3 mRNA水平越高，患者預后的越差。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因在不同卵巢癌研究芯片中的表達

圖3 卵巢癌與其相應(yīng)的正常卵巢上皮組織的hMTERF3蛋白的表達（＊P＜0.05）

圖4 hMTERF3表達量與卵巢癌患者預后的關(guān)系

3 討論

卵巢癌發(fā)病的病因目前并不明確，可能與外部因素（包括物理、化學、生物致癌因子）和內(nèi)部因素（包括免疫功能、內(nèi)分泌、遺傳、精神等因素），以及飲食營養(yǎng)失調(diào)和不良生活習慣等相關(guān)［11-13］。MTERF3是MTERF蛋白家族進化最保守的成員，基因敲除MTERF3的純合子小鼠將導致胚胎發(fā)育異常和死亡［14，15］。體外凝膠遷移實驗（EMSA）和體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀實驗 （ChIP）證實，哺乳動物MTERF3能與線粒體重鏈轉(zhuǎn)錄起始位點結(jié)合，缺失MTERF3將導致線粒體DNA轉(zhuǎn)錄起始水平的增加，則進一步證實哺乳動物MTERF3是一種線粒體基因轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控因子［5］。Wrdenberg等報道，MTERF3蛋白還能調(diào)節(jié)線粒體中核蛋白體大亞基的組裝，影響核蛋白體的生物合成，導致氧化磷酸化水平降低，細胞內(nèi)能量合成減少［16］。Oncomine是一個大型的腫瘤基因芯片分析整合數(shù)據(jù)庫，為廣大的科研工作者提供公開、免費的整合分析資源，數(shù)據(jù)來源為公開發(fā)表的各種高通量基因測序數(shù)據(jù)。Oncomine平臺為不熟悉高通量分析的科研工作者提供了一個便捷的方式獲取整合信息，只需要輸入基因名稱即可得到該基因在各種類型腫瘤中的mRNA表達水平差異等分析結(jié)果，并且以直觀的形式輸出［17］。通過對Oncomine數(shù)據(jù)庫的整合分析，筆者發(fā)現(xiàn)hMTERF3在卵巢癌組織中顯著高表達。目前研究報道，hMTERF3基因在肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中高表達［18］，但是該基因在卵巢癌中的研究相對較少。筆者對hMTERF3基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫中表達情況分析，發(fā)現(xiàn)該基因在大部分腫瘤類型中均呈現(xiàn)高表達（表1），這一結(jié)果也證實了已有的報道。該研究還采用Western blot技術(shù)對30例卵巢癌組織及其配對的正常卵巢上皮組織中hMTERF3蛋白表達水平進行分析，檢測發(fā)現(xiàn)28例（93.33%）卵巢癌組織中hMTERF3蛋白比正常卵巢上皮組織中呈顯著的高表達（P＜0.05），使結(jié)果得到實驗證實。該研究的不足之處為樣本數(shù)量有限，亟待擴大樣本量進一步研究。

表2 各個分期卵巢癌患者的預后與hMTERF3 mRNA水平的關(guān)系

Kaplan Meier Plotter是目前世界上被廣泛接受的一個預后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫，總計涵蓋了10 461例腫瘤樣本，其中包括5143例乳腺癌樣本、1816例卵巢癌樣本、2437例肺癌樣本和1065例胃癌樣本，可以對54 675個基因進行相關(guān)預后分析，并得出真實可信的客觀結(jié)果［19，20］。該文首次通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了hMTERF3基因表達水平在卵巢癌患者及不同分期卵巢癌患者中的預后價值。結(jié)果顯示，卵巢癌臨床分期未明時，hMTERF3表達量越高，卵巢癌的預后越差，是一個理想的預測卵巢癌預后的分子標記；在1期、1+2期及2期卵巢癌中，當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為PFS時，HR值均大于1。其中1+2期卵巢癌HR值為2.43，log rank P＜0.01；該期截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS時，HR值1.75，log rank P=0.1698。考慮到 OS 為總生存率患者死亡原因多樣（存在非腫瘤致死），且P值較小，推測hMTERF3可很好地預測早期卵巢癌患者預后；當截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS時，在1期，1+2期，2期，2+3期，2+3+4期，3期，3+4期及4期卵巢癌患者中HR值均大于1，說明hMTERF3表達水平對早、中、晚期卵巢癌患者均具有很好的預后價值。

總之，該研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫對腫瘤相關(guān)基因的信息進行深入挖掘，提出hMTERF3在卵巢癌組織中高表達；通過Western blot對卵巢癌及其配對的正常卵巢上皮組織中hMTERF3蛋白水平進行檢測，實驗證實hMTERF3在卵巢癌組織中高表達；進一步分析hMTERF3表達對卵巢癌患者預后的影響，發(fā)現(xiàn)hMTERF3高表達與卵巢癌患者的預后不良有關(guān)，將為進一步探討hMTERF3在卵巢癌發(fā)生中的作用提供重要的理論和實驗依據(jù)。此外，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進行惡性腫瘤及其對應(yīng)正常組織的基因表達差異分析，對普通科研工作者整合分析大量腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)，尋找潛在的感興趣的腫瘤相關(guān)基因具有參考價值。

參考文獻

［1］SIEGEL RL，MILLER KD，JEMAL A.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

［2］ZHOU J，HUANG XH.Review of the treatment of ovarian cancer［J］.Modern Oncology，2012，20（6）：1308-1311.

［3］ROBERTI M，POLOSA P L，BRUNI F，et al.The MTERF family proteins：mitochondrial transcription regulators and beyond［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1787（5）：303-311.

［4］XIONG W，YU M，ZUO SY.Regulatory roles of mitochondrial transcription termination factor（MTERF） family proteins in mitochondrial gene expression［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2015，31（3）：223-231.

［5］PARK CB，ASIN-CAYUELA J，CAMARA Y，et al.MTERF3 is a negative regulator of mammalian mtDNA transcription ［J］.Cell，2007，130（2）：273-285.

［6］ANDERSSON DC，F(xiàn)AUCONNIER J，PARK CB.Enhanced cardiomyocyte Ca（2+） cycling precedes terminal AV-block in mitochondrial cardiomyopathy Mterf3 KO mice［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（9）：2455-2464.

［7］BONOME T，LEVINE DA，RANDONOVICH M，et al.A gene signature predicting for survival in subopimally debulked patients with ovarian cancer［J］.Cancer Res，2008，68（13）：5478-5486.

［8］HENDRIX ND，WU R，KUICK R，et al.Fibroblast growth factor 9 has oncogenic activity and is a downstream target of Wnt signaling in ovarian endometrioid adenocarcinomas［J］.Cancer Res，2006，66（3）：1354-1362.

［9］LU KH，PATTERSON AP，WANG L，et al.Selection of potential markers for epithelial ovarian cancer with gene expression arrays and recursive descent partition analysis［J］.Clin Cancer Res，2004，10（10）：3291-3300.

［10］YOSHIHARA K，TAJIMA A，KOMATA D，et al.Gene expression profiling of advanced-stage serous ovarian cancers distinguishes novel subclasses and implicates ZEB2 in tumor progression and prognosis［J］.Cancer Sci，2009，100（8）：1421-1428.

［11］JI XN，F(xiàn)ENG YJ.Progress in study of etiology of ovarian epithelial cancer［J］.China Oncology，2014，24（11）：861-864.

［12］LIAO XY.Risk factors of epithelial ovarian cancer recurrence［J］.Modern Oncology，2016，24（14）：2283-2285.

［13］ZHAO XC，HUANG HB.The immunological etiology research progress of ovarian cancer［J］.Chinese Journal of Immunology，2014，30（6）：862-865.

［14］ROBERTI M，BRUNI F，LOGUERCIO-POLOSA P，et al.MTERF3，the most conserved member of the mTERF-family，is a modular factor involved in mitochondrial protein synthesis［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1757（9/10）：1199-1206.

［15］SPAHR H，SAMUELSSON T，HALLBERG BM，et al.Structure of mitochondrial transcription termination factor 3 reveals a novel nucleic acidbinding domain［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，397（3）：386-390.

［16］WRDENBERG A，LAGOUGE M，BRATIC A，et al.MTERF3 regulates mitochondrial ribosome biogenesis in invertebrates and mammals［J］.PLoS Genet，2013，9（1）：e1003178.

［17］LI L，XIONG GP，YAN L，et al.Expression and significance of CCNB1 in ovarian cancer［J］.Current Advances in Obstetrics and Gynecology，2016，25（11）：818-820.

［18］ZHANG C，WU N，GAO F，et al.MTERFD1 functions as an oncogene［J］.Oncotarget，2016，8（38）：1-10.

［19］SZASZ AM，LANCZKY A，NAGY A，et al.Cross-validation of survival associated biomarkers in gastric cancer using transcriptomic data of 1065 patients［J］.Oncotarget，2016，7（31）：49322-49333.

［20］OCANA A，PEREZ-PENA J，ALCARAZ-SANABRIA A，et al.In silico analyses identify gene-sets，associated with clinical outcome in ovarian cancer：role of mitotic kinases［J］.Oncotarget，2016，7（16）：22865-22872.