咖啡酸對輻射損傷小鼠造血調控因子表達的影響＊

杜遵民，賈海鵬，劉 靜，楊莉莉，陳方國

隨著核能及放射技術在國防和民用領域的廣泛應用，輻射防護的研究再次成為熱點，造血系統更新活躍，對輻射高度敏感，輻射損傷后主要表現為不同程度的造血功能障礙［1］，是急性放射病發病的重要基礎及預防診治的關鍵問題。筆者早期研究［2］發現咖啡酸（caffeic acid，CFA）對輻射損傷小鼠造血恢復有促進作用。該研究以X射線照射小鼠為模型，旨在觀察CFA對輻射損傷小鼠的造血調控因子粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影響，探討CFA促進造血恢復的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 咖啡酸原藥，山東德州德藥制藥有限公司生產，淡黃色，粉末狀，無臭，味微酸，水溶液呈酸性反應，批號110301。

1.1.2 實驗動物 12～16周齡的SPF級近交系BALB/c小鼠 42只，雌雄各半，體重 25～29 g，購自山東大學實驗動物中心，合格證號：20090001。小鼠照射前1周至照射后2周飼養于無菌層流室，飲水為含慶大霉素（32×104U/L）的高壓滅菌水。

1.1.3 主要儀器 X射線直線加速器，美國Rad Source Technologies公司RS2000PRO型;全自動血細胞分析儀器儀，深圳市普康電子有限公司PE－6800VET 型。小鼠血清 G－CSF、TPO、IL－1β 和 TNF－α ELISA試劑盒，上海藍基生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 實驗分組及給藥方法 SPF級近交系BALB/c小鼠隨機分為3組：空白對照組，單純照射組，CFA組，每組14只。CFA組：照射當天開始咖啡酸100 mg/kg·d灌胃，1次/d，連續灌胃至照射后 14 d；CFA灌胃液配制：因CFA不溶于水，置于水中有較多沉淀，故將CFA原藥溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉中制備成濃度10 mg/ml的混懸液，臨用前新鮮配制，一次灌0.1 ml/10 g。單純照射組：照射后當天開始等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃;空白對照組：不照射，僅給予等量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃。

1.2.2 照射方法 照射前將小鼠置于升降操作臺上的淺底分隔木盒內，盒內小鼠呈輻射狀分散排列，加蓋有機玻璃固定，照射源距小鼠50 cm。受試小鼠接受X射線直線加速器一次性全身照射，吸收劑量率 1.21 Gy/min，照射時間為 223 s，照射劑量為4.5 Gy。空白對照組設置類似環境，佯照射。

1.3 造血調控因子G-CSF、TPO、IL-1β和TNF-α的水平檢測每組選12只分別于照射后4 d、14 d各取6只，摘除眼球取血，室溫放置2 h，4℃冰箱內3～4 h，待血液凝固收縮后，2500 rpm離心10 min，取上清保存于－80℃。分別嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定血清 G－CSF、TPO、IL－1β 和TNF－α的含量水平。

1.4 統計學分析采用SAS8.1統計軟件處理數據，各數據用均數±標準差（x±s）表示。采用t檢驗或單因素方差分析（采用SNK法進行兩兩比較）進行組間比較。 檢驗水準 α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CFA對輻射后小鼠造血調控因子G-CSF、TPO、IL-1β水平的影響照射后4 d、14 d各受照組小鼠造血正性調控因子G－CSF、TPO水平較空白對照組明顯升高（P＜0.05）。 照射后 4 d、14 d CFA 組小鼠G－CSF、TPO水平明顯高于單純照射組 （P＜0.05），見表 1、2。

表1 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 G-CSF 水平變化，ng/L）

表1 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 G-CSF 水平變化，ng/L）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d與 4 d 比較，△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對照組 6 494.10±45.27 490.76±28.10單純照射組 6 846.56±21.29＊ 640.16±31.11＊△CFA 組 6 1523.23±93.12＊# 1773.13±103.01＊#△

表2 各組小鼠輻射后4d和14d血清TPO水平變化pg/ml）

表2 各組小鼠輻射后4d和14d血清TPO水平變化pg/ml）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d 與 4 d 比較，△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對照組 6 2252.33±74.87 2322.27±111.06單純照射組 6 3341.58±53.77＊ 3008.25±75.95＊△CFA 組 6 4436.22±110.11＊# 4769.55±123.02＊#△

照射后4 d和14 d單純照射組與CFA組小鼠IL－1β 水平均較空白對照組明顯升高（P＜0.05）。 4 d單純照射組與CFA組IL－1β水平組間比較無明顯差異（P＞0.05），14 d CFA 組 IL－1β 水平高于單純照射組（P＜0.05）。 單純照射組小鼠 14 d IL－1β 水平低于 4 d（P＜0.05），而 CFA 組 14 d IL－1β 水平高于4 d（P＜0.05），差異均有統計學意義，見表 3。

表3 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 IL-1β 水平變化（，ng/L）

表3 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 IL-1β 水平變化（，ng/L）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d 與 4 d 比較△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對照組 6 172.02±25.49 165.78±19.58單純照射組 6 240.58±23.15＊ 208.44±16.38＊△CFA 組 6 235.42±27.31＊ 265.39±12.65＊#△

2.2 CFA對輻射后小鼠造血調控因子TNF-α水平的影響照射后4 d和14 d單純照射組與CFA組小鼠TNF－α水平均較空白對照組明顯升高 （P＜0.05），CFA 組明顯低于單純照射組 （P＜0.05）。 單純照射組小鼠 14 d TNF－α 水平高于 4 d （P＜0.05），CFA 組 14 d TNF－α 水平低于 4 d（P＜0.05），見表 4。

表4 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 TNF-α 水平變化ng/L）

表4 各組小鼠輻射后4 d和14 d 血清 TNF-α 水平變化ng/L）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與單純照射組比較，#P＜0.05；單純放射組、CFA 組 14 d 與 4 d 比較，△P＜0.05。

組別 n 4 d 14 d空白對照組 6 450.56±34.46 457.26±25.24單純照射組 6 1285.55±89.09＊ 1678.58±110.98＊△CFA 組 6 929.13±74.79＊# 805.79±58.44＊#△

3 討論

在正常生理條件情況下，造血正性調控因子，如G-CSF、TPO、IL-1β和造血負性因子，如TNF-α它們組成的網絡共同調控造血干祖細胞分化、增殖、成熟和釋放、凋亡過程，并維持血細胞的數量和比例在某一穩定水平。G-CSF是由骨髓基質細胞如巨噬細胞和內皮細胞、纖維細胞釋放的細胞因子，主要參與粒細胞的造血調控［3］；TPO主要由肝臟產生，少量在腎和骨髓產生，刺激造血干細胞向巨核細胞分化增殖、成熟，產生和釋放血小板，血漿 TPO水平與血小板數成負相關［4］。IL-1β主要由單核巨噬細胞產生，是一種多能造血干細胞生長因子，能誘導成纖維細胞和內皮細胞釋放集落刺激因子，能促進骨髓原始造血細胞集落增殖［3］。TNF-α是TNF受體超家族的成員之一，是由激活的單核巨噬細胞等分泌產生的一種多效性細胞因子，可抑制骨髓CFU-GM、CFU-E 和 BFU-E 的增殖［5］。 在體內外這些正性調控因子均能強烈刺激造血祖細胞增殖，分泌并形成CFU-GM、CFU-MK等細胞集落。但當機體遭受輻射損傷后，骨髓微環境中的造血正性因子早期會增加，造血負性因子增加更為明顯，打破體內造血因子的平衡，抑制骨髓造血［6］，主要表現為不同程度的造血功能障礙［1，7］，外周血出現白細胞、血小板和紅細胞先后明顯下降，易致免疫力降低、感染和出血、衰竭，體重下降，甚至死亡。造血負性因子的增強是輻射造血損傷的一種促進因素［8］。該實驗觀察到單純照射組小鼠照射后4 d、14 d造血調控因子 G-CSF、TPO、IL-1β和 TNF-α水平均較空白對照組明顯升高；照射后14 d G-CSF、TPO和IL-1β水平低于照射后4 d，而照射后14 d TNF-α水平高于照射后 4 d，與文獻報道［6，8］的造血正性調控因子輻射后先升高后降低、負性調控因子持續升高的規律的結果一致。

CFA 化學名稱 3-（3，4-二羥苯基）-丙烯酸，廣泛存在于西紅柿、草莓、胡蘿卜、咖啡和谷類等多種可食性植物及中草藥如小薊中。文獻表明CFA可以促進化療相關性骨髓抑制的恢復，提升白細胞和胸腺指數，改善毛細血管通透性，減少感染和出血［9］。CFA還可通過刺激巨核細胞成熟和刺激粒細胞增殖、分化、成熟、釋放而提升血小板［10］。CFA具有收縮微血管、提高凝血因子水平、升高白細胞、血小板及止血的作用，臨床上用于各種原因引起的白細胞減少癥、血小板減少癥的治療。本實驗結果顯示CFA組照射后4 d、14 d小鼠G-CSF、TPO水平明顯高于單純照射組，照射后14 d小鼠G-CSF、TPO和IL-1β水平明顯高于照射后4 d；CFA組照射后4 d、14 d小鼠TNF-α水平明顯低于單純照射組，照射后14 d小鼠TNF-α水平低于照射后4 d，表明CFA對輻照后小鼠G-CSF、TPO、IL-1β等造血正性調控因子水平有上調作用，對造血負性調控因子TNF-α水平有下調作用。

筆者的早期研究［2］觀察到CFA明顯提高輻射損傷小鼠的白細胞、血紅蛋白、血小板計數，增加CFU-GM、CFU-MK、CFU-S和 SI的數量，其機制可能正是CFA對輻照后小鼠造血調控因子的影響所致。這為CFA應用于輻射防護與治療提供了實驗依據，有關CFA對輻射損傷保護的最佳劑量、應用的最佳時機以及作用機制尚需進一步研究。

參考文獻

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