清熱利濕方及虎杖苷對SD大鼠肛旁創面肉芽組織血管通透性及Src、VE-cadherin細胞因子表達的動態影響

楊豪杰，王振宜，劉 華

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院肛腸科，上海 200437）

肛腸術后創面多表現為皮膚潮濕、創面滲液、膿液黏稠較多、肉芽組織淡紅，全國名老中醫柏連松教授歸之于“濕熱下注”之癥[1-2]。現代醫學認為創面紅腫熱痛（局部濕熱）程度與毛細血管滲出、局部炎癥反應、細菌感染密切相關，而血管通透性增加是其關鍵病理改變。最新研究表明Src/VE-cadherin信號通路在調節血管通透性，控制炎癥反應等方面起著重要作用[3-4]。本研究以SD大鼠肛旁創面模型為研究對象，進一步研究清熱利濕方及虎杖苷通過調控血管通透性促進創面愈合的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 采用清潔級SD大鼠108只，雄性，體質量（300±50）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2012-0002。于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院動物房適應性飼養1個月。

1.2 藥物與試劑 清熱利濕方采用柏連松教授經驗方，由虎杖20g，蒲公英20g，苦參10g，黃柏10 g組成，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院制劑室按比例制備成熏洗液備用（實際外洗比例為水煎劑:水=1:9）。生理鹽水（上海國藥集團化學試劑有限公司產品），虎杖苷（上海同田生物技術有限公司產品），伊文氏藍晶體（美國Sigma lifes cience公司產品）。伊文氏藍溶液的配制方法：稱取伊文氏藍晶體1g，加入100mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，溶解后加1mL1%Na2CO3溶液過濾；4℃保存。臨用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀釋成0.01%濃度使用。Src、VE-cadherin Elisa試劑檢測盒（上海源葉生物科技有限公司產品，批號E20160901A）。

1.3 儀器 酶標儀（epoch，Bio-Tek公司產品）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及干預 將大鼠隨機分為清熱利濕組、虎杖苷組、生理鹽水組，每組36只。參照岑瑛的方法[5]于術前3 d用8% Na2S脫毛，造模時用10%水合氯醛麻醉（每100 g 大鼠體質量0.4 mL）。使用自制手術器械在大鼠臀部做直徑1.8 cm，面積為2.54 cm2的圓形切口創面，全層切除皮膚及筋膜直至肌肉表層。止血后放入清潔代謝鋼絲籠內飼養，不予包扎任其自然感染，形成肛旁創面模型。術后24 h起，各組分別用藥物或生理鹽水浸浴治療，2次/d，20 min/次。藥液以沒大鼠創面上3 cm為度，鐵絲籠置40 ℃電熱恒溫水浴箱，待藥液達40 ℃時開始外洗。

2.2 取材 每組大鼠中隨機選取36只，分別于術后第3、7、11 天每組各選12只取局部創面肉芽組織待用；其中4只行尾靜脈注射伊文氏藍溶液（30 μg/g，PBS 100 μL /只），30 min后取局部創面肉芽組織待用。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 肉眼觀察 肉眼觀測術后第3、7、11 d各組創面愈合情況。

2.3.2 血管通透性 將經伊文氏藍染色后的肉芽組織分別精密稱取（105±5）mg，溶于有機溶劑Formamide（2 mL）中，室溫下靜置48 h，使用移液器吸取200 μL上清液，置于全自動酶標分析儀中（檢測波長420 nm）測量OD值。

2.3.3 Src、VE-cadherin含量測定 測定方法參考Src、VE-cadherin Elisa試劑盒說明書。

2.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計。計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料用率（%）表示，多組計量資料如服從正態分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析，組內比較用配對t檢驗，方差不齊，先校正方差，然后進行方差分析；重復測量數據采用重復測量的方差分析；不服從正態分布者，采用非參數檢驗；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α = 0.05。

3 實驗結果

3.1 肉眼觀察 術后第3天生理鹽水組大鼠創面有較多滲液，創面紅腫，水腫較為明顯；虎杖苷組大鼠創面有少量滲液，明顯少于生理鹽水組，部分創面伴有紅腫；清熱利濕組的滲液基本消失并開始結痂愈合，未見明顯紅腫，創面水腫不明顯。術后第7天生理鹽水組大鼠創面仍有少量滲液，且滲液明顯多于其余兩組，創面紅腫較明顯，但較術后第3天已有明顯改善；虎杖苷組大鼠創面滲液基本消失，創面仍伴有可見紅腫；清熱利濕組的愈合情況較好，創面滲液消失，已基本接近愈合，未見明顯水腫和滲出。術后第11天生理鹽水組大鼠創面有少量滲液，創面較其余2組紅腫略明顯；虎杖苷組仍有少量滲液，多于清熱利濕組，創面水腫不明顯；清熱利濕組的愈合情況較好，創面滲液消失，未見明顯水腫和滲出。

3.2 血管通透性 經單因素方差分析，術后第3天 3組伊文氏藍滲出比較差異有統計學意義（P＜0.05）；術后第7，11天3組伊文氏藍滲出比較差異無統計學意義（P＞0.05），故對術后第3天進一步比較。經LSD-t檢驗，結果提示術后第3 天清熱利濕組與虎杖苷組伊文氏藍滲出情況比較差異無統計學意義（P＞0.05），但二者滲出均少于生理鹽水組（P＜0.05）。見表1。

表1 術后第3、7、11 天各組伊文氏藍OD值比較（±s ，n =4）

表1 術后第3、7、11 天各組伊文氏藍OD值比較（±s ，n =4）

注：與生理鹽水組比較，# P＜0.05

組 別 第3天 第7天 第11天清熱利濕組 3.65±0.17# 1.28±0.27 1.23±0.19虎杖苷組 3.72±0.12# 1.26±0.32 1.25±0.14生理鹽水組 4.07±0.21 1.69±0.65 1.27±0.21

3.3 Src、VE-cadherin含量 Elisa法檢測各組創面肉芽組織中Src、VE-cadherin含量。Elisa結果顯示術后第3、7、11天各組肉芽組織中Src濃度均存在明顯差異，差異有統計學意義（P＜0.05）。術后第3、7天，生理鹽水組Src濃度大于其他2組（P＜0.05），清熱利濕組與虎杖苷組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后第11天，生理鹽水組的Src濃度大于其他2組的Src濃度（P＜0.05），虎杖苷組Src濃度大于清熱利濕組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組肉芽組織Src濃度變化（±s ，n = 4） pg/mL

表2 各組肉芽組織Src濃度變化（±s ，n = 4） pg/mL

注：與生理鹽水組比較，# P＜0.05，與虎杖苷組比較，△P＜0.05

組 別 第3天 第7天 第11天生理鹽水組 4.66±0.08 4.45±0.20 3.89±0.27清熱利濕組 3.81±0.31# 3.23±0.56# 2.84±0.23#△虎杖苷組 4.07±0.20# 3.58±0.04# 3.35±0.17#

Elisa結果顯示術后第3、7天各組肉芽組織中VE-cadherin濃度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。術后第11天，生理鹽水組的VE-cadherin濃度低于其他2組（P＜0.05），虎杖苷組VE-cadherin濃度低于清熱利濕組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組肉芽組織VE-cadherin濃度變化（，n = 4pg/mL

表3 各組肉芽組織VE-cadherin濃度變化（，n = 4pg/mL

注：與生理鹽水組比較，# P＜0.05，與虎杖苷組比較，△P＜0.05

組 別 第3天 第7天 第11天生理鹽水組 4.09±0.20 4.27±0.16 4.60±0.09清熱利濕組 4.22±0.05 4.78±0.38 7.23±1.10#△虎杖苷組 4.08±0.20 4.38±0.26 5.67±0.28#

其中Src標準擬合曲線：Y=0.264X+0.118，R2=0.962；VE-cadherin標準擬合曲線：Y=0.32X+0.21，R2=0.971。通過450 nm波長測量所得的OD值在標準曲線上得出相應濃度后，乘以稀釋倍數（5倍），即為實際樣品濃度。

3 討論

創面炎癥滲出等濕熱證象的現代病理學關鍵是血管通透性增加。通透性過度在臨床上表現滲出增多，不利于創面愈合。血管內皮鈣黏附素（VE-cadherin）是血管內皮細胞黏附連接的主要成分，受Src調控。當Src分泌增多或活性增強，將使VE-cadherin 磷酸化后重新分布，使得內皮細胞間的緊密連接松脫，毛細血管內皮細胞之間縫隙加大，血管通透性提高。反之內皮細胞連接緊密，通透性降低[6-7]。因此，Src/VE-cadherin 信號通路在血管通透性中的作用受到高度重視。課題組前期在總結柏連松教授清熱利濕方外洗方基礎上，開展了一系列臨床與實驗研究，證實清熱利濕方外洗能有效改善患者傷口濕熱滲出癥狀，促進愈合[8-11]。進一步研究清熱利濕方及其有效成分通過調控血管通透性促進創面愈合的作用機制具有重要意義。

本研究通過肉眼觀察發現與生理鹽水相比，清熱利濕方與虎杖苷均能更有效控制創面炎性滲出，促進創面愈合。伊文氏藍染色法結果與肉眼觀察結果一致，清熱利濕方與虎杖苷均能降低血管通透性，進而控制局部炎癥，促進創面愈合。這一發現提示清熱利濕方及虎杖苷可能通過調控Src/VE-cadherin信號通路，降低局部創面通透性，促進創面愈合。因此課題組以Elisa法檢測其對創面肉芽組織Src、VE-cadherin細胞因子表達的動態影響，旨在初步驗證這一假說。結果表明清熱利濕方與虎杖苷均能抑制創面組織Src表達，清熱利濕方效果更佳。此外，結果還表明清熱利濕方與虎杖苷并不能非常有效提高創面組織VE-cadherin表達。Src/VE-cadherin信號通路是具有多生物學效性的細胞信號轉導途徑[12-15]，受血管內皮細胞生長因子（VEGF）、血管生成素I（AngI）等多種細胞因子的調控[16-18]。本研究初步發現清熱利濕方與虎杖苷主要通過抑制Src表達，調控Src/VE-cadherin信號通路，但其確切的作用機制仍懸而未決。此外，中醫復方是一個高度復雜的化學物體體系，清熱利濕方中的中藥活性成分可通過作用于多個靶點，影響多條信號轉導通路。除了虎杖苷，其他有效成分的作用機制及相互影響仍有待進一步研究。

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