梓醇對糖尿病心肌病大鼠心功能及心肌組織TGF-β1表達的影響

閆金慧，鄒國良

（1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬一院，哈爾濱 150040）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病重要的并發癥之一，目前西藥對本病的預防和癥狀緩解收效甚微。梓醇是地黃的提取物，有研究[1-2]表明梓醇可以加強骨骼肌對葡萄糖的吸收，促進肝糖原的生成，抑制糖異生來降低血糖，但對心肌保護方面鮮有報道，因此本研究旨在觀察梓醇對糖尿病心肌病的保護作用，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物造模及分組 動物造模及分組方法同本課題組前期動物實驗[3]。

1.2 心功能E/A、E/E'的測量 應用多普勒超聲心動圖檢測E/A及E/E'評估心肌舒張功能：測定二尖瓣舒張早期血流速度峰值（E）、二尖瓣瓣環舒張早期運動速度（E'）、二尖瓣舒張晚期血流速度峰值（A）。

1.3 組織標本采集與處理 灌胃12周后禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉（45 μg/g）腹腔給藥麻醉，將大鼠呈仰臥位展開固定于手術架上，沿腹正中線切開皮膚，迅速打開胸腔取出心臟，冰鹽水沖洗并剔除血管、被膜，濾紙吸干后沿室間隔分離左心室置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，待免疫組化染色分析。

1.4 免疫組織化學 按試劑說明書進行操作，應用Image-pro-plus6.0圖像分析軟件，從每組隨機選取5張切片，測定陽性染色物質的平均光密度（mean optical density，MOD），用積分光密度的平均值，來反映免疫反應物的表達強度。

1.5 統計學分析 實驗數據用統計軟件SPSS 22.0進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，干預前后數據比較采用t檢驗分析，組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 梓醇對大鼠心功能E/A及E/E'的影響 與正常組相比，模型組及各干預組E/A均減低，同時E/E'均增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，各干預組均可改善大鼠心功能E/A、E/E'，以高劑量組效果最佳（P＜0.05）。對照組與高、中劑量組E/A比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 梓醇對大鼠心肌組織TGF-β1的影響 由切片可看出TGF-β1的表達主要在心肌細胞胞漿內黃褐色為陽性信號。正常組僅可見少量散在分布于細胞膜，纖維結構完整，其余各組TGF-β1表達升高（P＜0.05）。與模型組比較，其他各組TGF-β1染色降低明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組胞漿內黃褐色顆粒沉積較少，呈弱陽性，心肌紋理較整齊，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

表1 梓醇對大鼠心功能E/A、E/E'的影響（±s ）

表1 梓醇對大鼠心功能E/A、E/E'的影響（±s ）

注：與正常組相比，# P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與對照組相比，▲P＜0.05

組 別 n E/A E/E’正常組 10 1.44±0.01 9.91±2.04模型組 7 0.48±0.12# 20.35±1.33#對照組 9 1.17±0.25#△ 13.37±1.11#△高劑量組 8 1.25±0.21△ 11.96±1.13#△▲中劑量組 8 1.07±0.13#△▲ 13.41±1.26#△▲低劑量組 7 0.96±0.09#△ 14.91±1.61#△

圖1 梓醇對大鼠心肌TGF-β1表達的影響（±s ）

3 討論

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的新鮮或干燥塊根，最早記載于《神農本草經》被列為上品，又被稱為“四大消渴圣藥”之一。梓醇是從地黃中提取以環烯醚萜類為主的活性成分，2010版《中國藥典》將梓醇作為地黃質量評價的重要指標，其中鮮地黃中梓醇含量最高。現代藥理研究發現梓醇具有利尿、降血糖、抗感染、抗腫瘤、神經保護[4-5]、有助于腦缺血后神經修復[6-7]、抗抑郁[8-11]、促進細胞增殖[12-13]、抑制氧化應激[14]等作用。

DCM病理學上主要表現為心肌細胞肥大和心肌間質纖維化，在以往的研究中普遍認為DCM是以心肌細胞肥大為主，但隨著研究的不斷深入，學者們逐漸注意到心肌纖維化（myocardial fi brosis，MF）在DCM的發生和發展中同樣起著不容忽視的作用，同時被認為是DCM特征性的病理改變[15-16]。 MF是多種心臟疾病發展到終末期的共同病理特征，發病機制復雜，受多種因素調控，其中轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是MF重要的促發因子，已成為治療新靶標。TGF-β在心肌細胞中主要表達的亞型是TGF-β1，在高糖狀態下，TGF-β1會持續增加，促使肌性成纖維細胞的增殖、分化，當其含量超過終止信號時會介導相應蛋白轉錄，從而使細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中膠原蛋白、纖維連接蛋白和蛋白多糖含量大幅增加，加劇膠原成分的累積，并減少膠原酶、彈性蛋白酶的分泌而抑制ECM降解[17-19]，膠原網絡發生改變，使心肌順應性下降，增加心肌僵硬度，影響心臟正常的收縮與舒張，造成MF的發生。TGF-β1還可調控下游蛋白信號傳導、介導炎癥因子使膠原蛋白的合成增多和抑制ECM降解，共同促成纖維化的發展[20-22]。但其若未被激活則不會發揮生物學效應，因此也可通過抑制其受體或與蛋白結合阻礙其致纖維化作用。

在本實驗中隨著用藥時間的延長，大鼠心功能指標有不同程度的改善，且呈劑量依賴性，相比模型組而言梓醇高劑量組可顯著升高E/A比值并降低E/E′比值，提示梓醇可明顯改善模型大鼠心功能及保護受損心肌。由此認為梓醇可能通過下調TGF-β1的表達從而達到對于受損心肌的保護作用，改善心肌舒張能力，調整心肌順應性，保證了心臟結構和功能的完整和協調性，對于延緩MF發生具有積極治療作用。

參考文獻：

[1]Huang W J, Niu H S, Lin M H, et al. Antihyperglycemic effect of catalpol in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Journal of Natural Products, 2010, 73(6):1170-1172.

[2]王祥,李長運,曾秋棠,等.大鼠2型糖尿病心肌病模型的建立方法[J].中國病理生理雜志, 2006, 22(9):1868-1870.

[3]鄒國良,仲維莉,許瑞,等.梓醇對2型糖尿病大鼠胰島細胞的保護作用[J].中西醫結合心腦血管病雜志, 2016,14(15):1727-1729.

[4]董炤,陳長勛.梓醇藥理作用的研究進展[J].中成藥,2013, 35(5):1047-1051.

[5]萬東,祝慧鳳,羅勇,等.梓醇對大鼠梗死灶周圍大腦皮質神經元樹突生長及突觸素表達的影響[J].中國藥理學通報,2012, 28(11):1515-1521.

[6]劉江月.梓醇抑制AGEs誘導的EA.hy926細胞炎癥反應及RAGE表達[J].中國病理生理雜志, 2015, 31(9):1693-1698.

[7]王君明,馮衛生,崔瑛,等.地黃醇提物及其藥渣水提物抗抑郁作用的比較研究[J].中國藥學雜志, 2014, 49(23):2073-2076.

[8]傅淑平,楊麗,洪浩,等.梓醇促進大鼠骨髓間充質干細胞增殖過程中Wnt信號通路的變化[J].中國病理生理雜志,2014, 30(9):1656-1660.

[9] Miao J X, Zhang X L, Ji X N. Anti-depressant effect of fresh Rehmann- ia glutinosa Libosch powder on mice[J].China J Chin Med, 2011, 26(7):813-815.

[10]Huang Yee, Jiang Chunmao, Hu Yuanliang, et al.Immunoenhancement effect of rehmannia glutinosa polysaccharide on lymphocyte proliferation and dendritic cell[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 96(2):516-521.

[11] Liu C L, Cheng Ling, Ko C H, et al. Bioassay-guided isolation of anti-inflammatory components from the root of Rehmannia glutinosa and its underlying mechanism via inhibition of iNOS pathway[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 143(3):867-875.

[12]賴滿香,楊麗,張榮華.梓醇對OB-OC共育體系中OB、OC活性及OBERα、βmRNA表達的影響[J].中國病理生理雜志, 2015, 31(7):1242-1246.

[13]劉江月.梓醇對糖尿病大鼠主動脈的保護作用與抗氧化機制研究[J].中國病理生理雜志,2014,30(6):1023-1028.

[14]王靜歡,鄒利,萬東.梓醇多效性相關信號通路研究進展[J].中國藥理學進展, 2015, 31(9):1189-1194.

[15]Chaturvedi R R, Herron T, Simmons R, et al. Passive stiffness of myocardium from congenital heart disease and implications for diastole[J]. Circulation, 2010, 121(8):979-988.

[16] Vadla G P, Vellaichamy E. Anti-fibrotic cardio protective efficacy of aminoguanidine against streptozotocin induced cardiac fibrosis and high glucose induced collagen up regulation in cardiac fibroblasts[J].Chemico-Biological Interactions, 2012, 197(2/3):119-128.

[17]肖一佳,沈祥春,李杰平,等.心肌纖維化與TGF-β-Smad信號系統[J].中國新藥雜志, 2016, 25(2):182-186, 192.

[18]楊錦龍,范忠才.轉化生長因子β1與心肌纖維化的研究進展[J].醫學理論與實踐, 2014, 27(8):1007-1008,990.

[19] Driesen R B, Nagaraju C K, Abi-char J, et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts[J].Cardiovascular Research, 2014, 101(3):411-422.

[20] Jiang Fan, Liu G S, Dusting G J, et al. NADPH oxidasedependent redox signaling in TGF-β-mediated fibrotic responses[J]. Redox Biology, 2014, 2(2):267-272.

[21]Samarakoon R, Overstreet J M, Higgins P J. TGF-β signaling in tissue fi brosis: redox controls, target genes and therapeutic opportunities[J]. Cellular Signalling, 2013, 25(1): 264-268.

[22] Ma F, Li Y, Jia L, et al. Macrophage-Stimulated Cardiac Fibroblast Production of IL-6 Is Essential for TGF-β/Smad Activation and Cardiac Fibrosis Induced by AngiotensinⅡ[J]. Plos One, 2012, 7(5):35144.