貯藏方法對紫花苜蓿種子內生根瘤菌定殖的影響

苗陽陽，周 彤,師尚禮，張運婷，康文娟(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有適口性好、蛋白質含量高、營養價值全面、利用年限長等特點，是世界范圍內種植面積最大、應用最廣的牧草[1]。根瘤菌可與其共生形成根瘤，將大氣中的無機氮轉化為有機氮，從而供給植物營養，形成根瘤。這一共生體系的固氮作用不僅具有巨大的經濟和社會效益，同時在改良土壤肥力、提高作物和牧草質量、產量、改善生態環境等方面具有重要意義。因此，在農業生產中，人工接種根瘤菌便成為一種常見的農業措施。但苜蓿結瘤和固氮受多種內在因素(苜蓿品種、根瘤菌種類)和外在因素(接種方法、環境因素、土壤狀況)影響，接種的根瘤菌難以高效地進行結瘤固氮，難以達到應有的增產效果[2-3]。因此，篩選出攜帶目標根瘤菌的苜蓿種子，在生產實踐中就可免去接種環節，實現了優良根瘤菌菌株與優良苜蓿品種的精準高效組合，為提高苜蓿良種生產效益奠定基礎。

研究表明，根瘤菌可以內生菌的形式廣泛存在于玉米、水稻、煙草、苜蓿等多種植物的根、莖、葉、莢果皮和種子內[4-7]。種子內的根瘤菌具有固氮、溶解無機磷和分泌生長素的能力[8]。根瘤菌可通過植物種子傳播到土壤中，種子是被子植物重要的繁殖器官，與其共生的根瘤菌是在漫長的自然選擇過程中產生的協同進化產物[9]。種子內生根瘤菌在構建共生固氮體系中比土壤中其他根瘤菌具有明顯的競爭優勢。當種子萌發后胚根首先接觸種子內部的根瘤菌即“內生根瘤菌”，然后才接觸到“土著根瘤菌”。因此，保證種子內根瘤菌的活性和數量，對根瘤菌高效固氮及各種促生作用的發揮具有重大意義。

紫花苜蓿多采用種子繁殖，種子用量很大。其種子粗脂肪含量高，不飽和脂肪酸的含量相對較低，容易導致種子氧化酸敗而不耐貯藏[10]。在種子保存期間，溫度是保持活力和生活力的關鍵因素，要想獲得高活力的種子，需要在種子收獲、采后處理、保存、包裝等各個環節進行嚴格的質量控制。適宜的溫度還可促進種子內微生物的繁殖。溫度可直接影響細菌的生理生化代謝途徑[11-13]，主要是通過影響微生物細胞內生物大分子的活性來影響微生物的生命活動[14]。低溫會減緩或停止微生物的代謝過程，溫度低于冰點時，可使原生質內的水分結冰，導致細胞死亡[15]。

雖然國內外對溫度和貯藏條件對種子活力的影響已有研究，但關于不同溫度下不同包裝材料對種子內微生物尤其是根瘤菌的影響較少。因此，以不同接種方法收獲的含目標根瘤菌的紫花苜蓿種子為試驗材料，在不同溫度下采用不同的包裝條件貯藏，探討利于保持種子內根瘤菌的活性和增殖的條件，明確不同貯藏方法對種子內根瘤菌定殖數量的影響，從而篩選出最適貯藏條件，為獲得含有大量攜帶有目標根瘤菌的苜蓿種子奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試苜蓿種子獲得：甘肅農業大學牧草實訓基地生長4年的甘農5號紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.5) ，在結莢期以主根輕微損傷澆灌、根部直接澆灌、加入600 mg/mL苦參堿(濃度1.3%)澆灌3種根部接種方法接種兩種熒光標記根瘤菌EnsifermelilotiLZgn5f (gn5f)和Ensifermeliloti12531f (12531f)，同時根部澆灌無菌蒸餾水獲得的種子。室內風干2個月進行貯藏。

1.2 試驗方法

1.2.1 含熒光標記根瘤菌種子的貯藏 于2014年11月初進行種子貯藏。采用鋁箔紙(種子用雙層鋁箔紙密封包裝)、信封+布袋(種子裝于布袋內，外加信封袋)、信封袋3種包裝方式，分別在25℃、25℃硅膠干燥、-4℃和4℃下貯藏6個月。

1.2.2 種子內生根瘤菌定殖數量的測定 隨機挑選各處理種子25粒，重復4次，置于50 mL無菌三角瓶內，碘伏 (有效碘濃度為2500 mg/L)浸泡3 min，無菌蒸餾水沖洗4次，每次1 min。操作均在無菌操作臺內進行。表面消毒后，將最后1次消毒的種子各面在固體培養基平板上放置30 min后取出，將平板28℃條件下培養24～48 h，未長出菌落，表明已徹底消毒[5]。將消毒后的種子置于無菌研缽中，加入2 mL無菌水研磨，吸取0.2 mL研磨至1.8 mL無菌蒸餾水中，制成10- 1稀釋液，再吸取該稀釋液0.2 mL至1.8 mL無菌蒸餾水中，制成10-2稀釋液，按照上述方法依次制成10-3和10-4濃度稀釋液，每一濃度梯度3 次重復，離心(4 000 r/min，離心2 min)后分別吸取0.2 mL上清液均勻涂布于含剛果紅的YMA固體培養中，28℃培養24～48 h記錄每皿中單菌落數量(剛果紅YMA培養基中，根瘤菌形態為含有粘質胞外多糖且不吸附色素的白色半透明菌落，形態為平坦凸起或半透明凸起，邊緣光滑)[16]。挑取每皿內大小形態一致的具代表性的菌落，編號保存，進行革蘭氏染色及形態學鏡檢[17]，初鑒別確定為根瘤菌后根據何慶元等[18]的方法進行保存并回接鑒定。

1.3 數據處理

利用Excel 2007整理數據并作圖，采用SPSS16.0軟件進行統計和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏方法對主根微破損接種gn5f和12531f獲得的種子內生根瘤菌定殖數量的影響

主根微破損接種gn5f時獲得的種子，信封包裝貯藏在-4℃時，內生根瘤菌定殖數量最高，為25.54 cfu/粒，顯著高于信封+布袋和鋁箔的2種包裝材料(P<0.05)。信封+布袋包裝貯藏各溫度下定殖的數量無顯著差異(P>0.05)，為1.74～5.34 cfu/粒。鋁箔包裝時，25℃干燥貯藏條件下定殖數量為13.28 cfu/粒，顯著高于其他3種貯藏溫度(P>0.05)。

主根微破損接種12531f時獲得的種子，鋁箔包裝貯藏在-4℃時，內生根瘤菌定殖數量最高，為14.98 cfu/粒，但與另外兩種包裝材料無顯著差異(P>0.05)，其余3個溫度下定殖的根瘤菌數量無顯著差異(P>0.05)。以信封包裝貯藏時各溫度下定殖的數量無顯著差異(P>0.05)，為0～1.58 cfu/粒。信封+布袋包裝時，在4℃干燥貯藏條件下定殖數量為5.48 cfu/粒，顯著高于其他3種溫度(P>0.05)。

表1 不同貯藏方法處理下主根微破損接種獲得的種子內生根瘤菌定殖數量Table 1 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with taproot slightly damaging and drench treatment cfu/粒

注：數據為平均值±標準誤，同列不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同貯藏方法對根部澆灌接種gn5f和12531f獲得的種子內生根瘤菌定殖數量

根部澆灌接種gn5f時獲得的種子，當以信封包裝并貯藏在25℃干燥條件下時內生根瘤菌定殖數量最多，為22.08 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。當以信封+布袋包裝貯藏于-4℃時種子內gn5f定殖數量為12.22 cfu/粒，顯著高于其他3個溫度下定殖的數量(P<0.05)。鋁箔包裝-4℃貯藏條件下gn5f定殖數量最多，為9.34 cfu/粒，但與在25℃下貯藏無顯著差異 (P>0.05)(表2)。

根部澆灌接種12531f獲得的種子，以信封+布袋包裝并在25℃干燥條件下貯藏時內生根瘤菌定殖數量最多，為40.84 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。以信封和鋁箔包裝時，25℃干燥貯藏時種子內定殖的12531f數量顯著高于其他3個溫度(P<0.05)，為1.28～19.64 cfu/粒(表2)。

表2 不同貯藏方法處理下根部澆灌接種獲得的種子內生根瘤菌定殖數量Table 2 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with root drench treatment

2.3 不同貯藏方法對添加苦參堿根部澆灌接種gn5f和12531f獲得的種子內生根瘤菌定殖數量的影響

添加苦參堿根部澆灌接種gn5f時獲得的種子，以鋁箔包裝并貯藏在-4℃時內生根瘤菌定殖數量最多，為25.00 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。以信封包裝時，貯藏于25℃干燥條件下時種子內gn5f定殖數量為15.40 cfu/粒，顯著高于其他3個貯藏溫度(P<0.05)。以信封+布袋包裝貯藏于25℃干燥條件下時種子內gn5f定殖數量最多，僅為7.66 cfu/粒，且僅顯著高于25℃時的定殖數量(P<0.05)(表3)。

添加苦參堿根部澆灌接種12531f時獲得的種子，以鋁箔包裝貯藏于25℃干燥條件下時內生根瘤菌定殖數量最多，為18.08 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)。以信封包裝時種子內12531f的定殖數量在各貯藏溫度間無顯著差異(P>0.05)，為0～4.94 cfu/粒。信封+布袋包裝，4℃貯藏時種子內定殖的12531f數量顯著高于其他3個溫度(P<0.05)，為5.34 cfu/粒。

2.4 不同貯藏方法對根部澆灌接種無菌蒸餾水獲得的種子內生根瘤菌定殖數量的影響

根部澆灌接種無菌蒸餾水獲得的種子，以鋁箔包裝并在25℃貯藏時內生根瘤菌定殖數量達最多，為10.42 cfu/粒，顯著高于其他貯藏溫度和包裝材料(P<0.05)，4℃貯藏時定殖數量次之，為6.48 cfu/粒，其余2個溫度下定殖的根瘤菌數量無顯著差異(P>0.05)。信封和信封+布袋在各處理溫度下種子內根瘤菌的定殖數量在1.20～5.32 cfu/粒(表4)。

表3 不同貯藏方法處理下添加苦參堿根部澆灌接種獲得的種子內生根瘤菌定殖數量Table 3 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with matrine treatment

表4 不同貯藏方法處理下無菌蒸餾水根部澆灌接種獲得的種子內生根瘤菌定殖數量Table 4 Effect of various storage methods on the colonization quantity of endogenous rhizobia in seed inoculated with sterile distilled water treatment

3 討論

根瘤菌是一種能與宿主植物互利共生的有益內生細菌，它可通過植物皮層進入木質部導管中，隨宿主的生長被運送到植物上部營養器官或繁殖器官中[19]。種子是豆科植物的主要繁殖器官，可進入新的土壤環境，成為下一代新植株內生根瘤菌的重要來源，為豆科植物-根瘤菌共生體系的構建提供了物質基礎，可促進次代植株的生長、改善土壤環境。試驗發現根瘤菌可通過主根微破損、根部澆灌、添加苦參堿根部澆灌的方法進入到苜蓿種子內，但因接種的目標根瘤菌遺傳特性不同，所適宜的接種方法也不同[20]。12531f的原始菌株12531為慢生型根瘤菌，代謝速率慢，而gn5f的原始菌株gn5為快生型根瘤菌，代謝速率快，二者遺傳性狀差異較大。試驗發現不同方法接種根瘤菌后獲得的種子，在適宜的包裝和溫度貯藏條件下，種子內生根瘤菌定殖數量高于接種無菌蒸餾水獲得種子的，表明接種目標根瘤后可增加苜蓿種子內生根瘤菌的定殖數量。接種gn5f獲得的種子在貯藏時，以信封或是鋁箔包裝時種子內生根瘤菌定殖數量多于信封+布袋，尤其是主根微破損接種獲得的種子在-4℃信封貯藏時內生根瘤菌定殖數量最多；接種12531f獲得的種子以信封+布袋或是鋁箔包裝時種子內生根瘤菌定殖數量多于信封包裝，尤其是根部澆灌獲得的種子在25℃干燥以信封+布袋貯藏時內生根瘤菌定殖數量最多。

祁娟[2]發現在-20℃處理下，所有供試苜蓿種子內生根瘤菌均不能存活，且在此低溫段，其他雜菌數量也很少，說明在-16℃～20℃存在著苜蓿種子內生根瘤菌存活的一個低溫臨界點，低于此溫度臨界點，苜蓿種子內生根瘤菌生長受阻。適宜的溫度下微生物才能生長繁殖，過高或過低的溫度均不利于微生物的生長和增殖，甚至死亡[21]。密封保存對毛竹種子生活力保存具有重要意義，空氣相對濕度較高的環境下保存，種子將從空氣中吸收水分而導致生活力下降[22]。蔡春菊等[23]同樣發現，在4℃保存2年的毛竹種子，雙層鋁箔袋密封并內置硅膠干燥的塑料盒內保存比牛皮紙袋保存的毛竹種子，更有利于延長種子壽命。

25℃干燥和-4℃貯藏時種子內根瘤菌數量高于25℃和4℃，可能是因為添加硅膠后降低了種子含水量，使一些核酸、酶類的分解代謝和次生產物的積累變緩，此時的種子可為根瘤菌提供一定的養分和良好的生長環境，因此，根瘤菌數量高于相同溫度時未干燥的處理。在4℃時種帶部分雜菌生長受到抑制，而-4℃時則大部分雜菌的生長受到抑制，但根瘤菌則能正常生長，因此-4℃時種子內生根瘤菌定殖數量多于4℃。3種包裝材料中，信封可使種子與外界環境進行充分的氧氣接觸，進行自由呼吸；信封+布袋可使種子進行適度的呼吸和與外部環境間的水熱交換；鋁箔則隔離外界水汽和熱量的效果較好，從而使種子處于相對干燥環境。但因收獲的種子含目標根瘤菌不同，所適宜的包裝材料也不同。

4 結論

綜合分析，接種gn5f獲得的種子在貯藏時，以信封或是鋁箔包裝時種子內生根瘤菌定殖數量多于信封+布袋，尤其是主根微破損接種獲得的種子在-4℃以信封貯藏時內生根瘤菌定殖數量最多；接種12531f獲得的種子以信封+布袋或是鋁箔包裝時種子內生根瘤菌定殖數量多于信封包裝，根部澆灌獲得的種子在25℃硅膠干燥以信封+布袋貯藏時內生根瘤菌定殖數量最多。但因收獲的種子含目標根瘤菌不同，所適宜的包裝材料不同。含相同目標根瘤菌的種子以25℃干燥和-4℃貯藏時種子內根瘤菌數量高于25℃和4℃。

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