高原鼢鼠微衛星多態位點篩選及其通用性檢測

康宇坤，張德罡，譚宇塵，王海芳，蔡卓山，蘇軍虎(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； .甘肅農業大學-新西蘭梅西大學草地生物多樣性研究中心，甘肅 蘭州 730070；)

微衛星(Microsatellite)DNA，是以2～6個堿基序列為核心單位，串聯排列的核苷酸序列，廣泛存在真核生物的基因組中[1]。由于操作難度低，包含信息豐富，在相關領域被學者們作為首選標記，廣泛運用。尤其在物種分化、遺傳多樣性、遺傳結構和資源保護利用管理中運用很廣[2-3]。由于微衛星引物的設計位置處在重復序列兩端的側翼序列，因此，相較于其他各種遺傳標記的方法，進行微衛星標記時，獲得其位點的序列信息是前提[4]。之后的首要步驟，就是對微衛星標記進行篩選。針對微衛星位點的發掘，方式眾多，隨著科技發展，最早的分離法已較少運用，各種富集法漸漸出現，使操作變繁為簡，大大增加工作效率[4]。跨種擴增及其通用性檢測是利用微衛星位點在親緣關系較近的物種中具有保守性的特點，在其他物種信息的基礎上，快速、高效的一種方法，已在部分研究中顯示出了極大價值[5-7]。

高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)隸屬嚙齒目(Rodentia)，鼴形鼠科(Spalacidae)，鼢鼠亞科(Myospalactinae)，凸顱鼢鼠屬(Eospalax)[8-9]，是分布于青藏高原的特有物種，為高寒草地生態系統中的固有成員，正常情況下，對草地適度的啃食對其生態系統有利，對整個草地生態環境起到了不可替代的重要作用[10]，作為草地生物多樣性的組成部分之一，其在草地生態系統具有特殊的地位，對于能量流通和物質循環有重要作用[11-12]，享有“生態系統工程師”的美譽[13]。隨著人類活動的影響，草地退化越來越嚴重，致使水土流失，生物多樣性越來越少，生態安全面臨嚴峻的形勢[14]，也使得草地管理利用問題更加突出[15]。高原鼢鼠物種演化歷史漫長，生活方式特殊，生態作用重要，因此相關領域的學者對高原鼢鼠產生了濃厚興趣[16-17]。然而，高原鼢鼠特有的地下生活方式，加之趨同、平行進化等影響，使得有關該物種的分類、生態等相關知識不足，亟需利用現代生物學技術進行補充佐證。高原鼢鼠多態性微衛星位點的獲得對開展有關高原鼢鼠的行為生態學、分子生態學和種群遺傳學相關研究，彌補傳統生態學研究具有重要的意義。通過提取不同地區高原鼢鼠種群DNA，候選鼴形鼠科(Spalacidae)和近緣種甘肅鼢鼠(Eospalaxcansus)的微衛星位點，在高原鼢鼠中進行PCR擴增及其多態性檢測，旨在為高原鼢鼠的分子遺傳生態方面的研究和高原鼢鼠高效科學的管理提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

試驗動物于2015年3～7月，采集于甘肅省省內現有分布地天祝、瑪曲、碌曲等。麻醉，血液采集完畢后并處死，同時解剖，取出肝臟組織，完成之后，用濃度為95%的乙醇保存，并將冰箱冷凍室溫度調節至-70℃，將組織樣本放入保存。參考類似研究[8]，和標本一一對照，根據特征進行物種的鑒定。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取與檢測 取0.3 g 新鮮的鼢鼠肝臟組織，按照常規的酚/氯仿抽提基因組DNA[18]。取2 μL總DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組。

1.2.2 SSR 引物的篩選及擴增 從同科的鼴鼠(Spalaxehrenbergi)的27對[19]，和同屬的甘肅鼢鼠的引物中選取60對，共87對[20]，上海生工生物工程技術服務有限公司完成合成工作。采用高原鼢鼠混合DNA 池作為模板來進行微衛星引物的摸索條件和擴增梯度工作，將引物的最優復性溫度和可用于高原鼢鼠的微衛星分析引物進行確定。

PCR 反應體系總體積25 μL，其組成為10×PCRbuffer 2.5 μL，10 mmol/L 4×dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL上下游引物各1 μL，TaqDNA 聚合酶1 U，50 ng/μL DNA 模板1 μL。反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性45 s，適宜的溫度退火30 s，72℃延伸30 s，循環30 次，72℃繼續延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 擴增產物的PAGE檢測及統計分析 電泳步驟與方法： 制膠(8.25 mL 30%貯液，11.75蒸餾水，5 mL的5×TBE，0.2 mL)、倒膠、點樣、進行電泳、染色(先固定在染色最后顯色)、制膜保存，最后觀察分析。電泳程序為首先50W預電泳30 min，點樣后50 W電泳4～5 h[21]。待膠板自然干燥后，用Epson V30掃描儀掃描膠。掃描圖像中，各位點等位基因的大小范圍以及最終數據的格式轉換工作均在Excel Microsatellite Tookit V3.1中進行。3個群體中，各微衛星位點中的5組數據計算工作在Popgene 1.31中完成，其中，包括多態信息含量(PIC)[22]、等位基因數(a)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)[23]以及有效等位基因數(Ne)[24]。

2 結果與分析

2.1 微衛星引物的篩選與擴增

篩選了鼴鼠的27對微衛星引物，甘肅鼢鼠的60對微衛星引物，以隨機混合的基因組DNA池為模板進行篩選。經過優化反應條件，87對引物中，PCR成功擴增了54對，其中鼴鼠的微衛星引物擴增率較低，僅有17對具有穩定的條帶，但其中有部分位點條帶多，不易區分，全表現為單態。甘肅鼢鼠中有43對擴增成功，但只有9對引物的擴增片段有較穩定的多態性，其余都表現為單態，部分擴增結果見圖1和表1。

圖1 部分位點的電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis patterns of some loci in Eospalax baileyi注：圖中1～7分別是不同的微衛星位點

2.2 微衛星擴增圖譜的分析

通過分析高原鼢鼠中9個微衛星位點的擴增圖譜，發現在諸如無論是否進行擴增，無論等位基因長度分布范圍如何和無論各位點擴增的等位基因數量為多少等相關問題上，不同種之間存有差異。在等位基因長度分布范圍方面，鼴形鼠、甘肅鼢鼠和高原鼢鼠等位基因大小范圍有明顯的區別。ECT21 位點上，高原鼢鼠的等位基因大小為190～220 bp，明顯大于該位點上甘肅鼢鼠的擴增片段。此外，甘肅鼢鼠與高原鼢鼠在ECT110位點上擴增片段的大小不同，同時對EBGA16、EBGA54位點上的擴增片段大小進行比對后，結果表明甘肅鼢鼠與高原鼢鼠同樣存在差異(圖2)。分析各微衛星位點所得到的等位基因數，結果顯示差異同樣存在于各種類之間。

圖2 位點EBGA16的電泳效果Fig.2 Electrophoresis photograph of EBGA16注：圖中1～22分別是高原鼢鼠種群不同的個體，下同

圖3 位點ECT110的電泳效果Fig.3 Electrophoresis photograph of ECT110

2.3 多態信息含量、遺傳雜合度及Hardy-Weinberg 檢驗

采用之前所篩選的9個具有多態性的微衛星位點，開始50個高原鼢鼠的基因組DNA 的PCR 擴增及電泳檢測。等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度等數據在Popgene 1.32軟件和Microsatellite toolkit中進行分析、統計(表1)。等位基因數在4～12，有效等位基因數平均為3.505，除EBGA26位點外，其余位點均處于哈代溫伯格平衡狀態(表1)。

3 討論

3.1 引物通用性分析

微衛星特性突出，被廣泛認可，使用其作為群體遺傳學研究的標記，效果顯著[25]，而從近緣種已有的微衛星標記中篩選被研究物種的標記，被認為是一種快速而有效的方法[6]。通過對鼴鼠、甘肅鼢鼠已有的微衛星標記引物進行篩選，選出鼴鼠的27對微衛星引物，甘肅鼢鼠的60對微衛星引物，并對87對引物進行PCR擴增，其PCR成功擴增了54對，其中鼴鼠的微衛星引物擴增率較低，僅有17對具有穩定的條帶，但其中有部分位點條帶多，不易區分，全表現為單態。甘肅鼢鼠中有43對擴增成功，多態位點豐富。這一引物通用性情況低于其他近緣種微衛星標記的平均通用性，相比而言，屬于正常波動的范圍[25]。盡管有類似研究表明,運用一種微衛星引物即可擴增同一屬、科、目下的不同物種，但此次研究中與鼴鼠的通用性較差，顯示了物種之間的差別。而在同屬的甘肅鼢鼠中通用性很好，也進一步說明了親緣關系對跨種應用的影響。孫波等[26]對社鼠(Niviventerconfucianus)近緣物種大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)中已知的70個微衛星位點引物進行跨種擴增，篩選到13個適合社鼠相關研究的多態微衛星引物。但研究未在同科的物種中檢測到通用性，這可能和物種的生物學特性有關，筆者研究的物種是地下特有的類群，地下的生物在遺傳變異方面有別于其他物種。

表1 鼢鼠群體的遺傳多樣性指數Table 1 Genetic diversity analyses of plateau zokor

3.2 在不同種中擴增狀況的差異

目前，微衛星標記的篩選方式很多，以通過構建特定大小片段的基因組文庫或微衛星富集文庫進行篩選、從已經公布的序列中篩查微衛星標記和利用近緣種之間引物的通用性得到目的物種的微衛星標記等[24]。一般而言，微衛星的通用性及擴增出的多態性位點比例隨著遺傳距離的增加呈減少的趨勢。此次試驗中，鼴鼠和甘肅鼢鼠的微衛星標記在其遺傳距離較遠的親緣種高原鼢鼠當中，能夠進行擴增的微衛星位點及等位基因數相對較少。對于高原鼢鼠，現有的基因組信息不足，還沒有進行近緣種基因組測序。此次試驗依據鼴型鼠科的物種進行了嘗試，但跨科擴增的多態性很低。

如果微衛星核心單元的重復次數發生改變，或者將DNA片段插入側翼序列中，甚至DNA片段的缺失，無論任何情況皆可使差異出現在不同物種間等位基因長度的分布范圍當中[25]。所出現的差異可用于物種的鑒定，尤其對于近緣種的DNA。研究獲得部分位點在高原鼢鼠中科進行擴增，但在甘肅鼢鼠中沒有多態，是物種特異性的標記。此外，部分位點的等位基因長度分布范圍差異明顯，可采用作為候選標記，不但可以進行分子鑒定，而且可以進行親子鑒定，來確定這幾種鼢鼠與其雜交后代的關系。等位基因的數量可看做一種參考，來對近緣種進行鑒定[27]。獲得的微衛星位點對進一步高原鼢鼠的研究和應用等奠定了基礎。

4 結論

從已開發微衛星信息的鼴形鼠科和甘肅鼢鼠物種中進行了高原鼢鼠微衛星多態性位點及其通用性研究，結果表明，在87對微衛星位點中，只有54對進行了成功擴增，多態位點僅有9個，27個鼴形鼠科物種的微衛星在高原鼢鼠中并沒有多態性，9個多態位點全來自于同屬的甘肅鼢鼠?；讷@得的9個多態位點，檢測到高原鼢鼠的等位基因數在4～12，其平均觀測雜合度(Ho)0.544，期望雜合度(He) 0.671，多態信息含量0.551，研究為高原鼢鼠的微衛星標記應用奠定了基礎。

參考文獻:

[1] Litt M,Luty J A.A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotiderepeat within the cardiac muscle actin gene[J].American Journal of Human Genetics,1989,44(3):397.

[2] Santana Q C,Coetzee M P A,Steenkamp E T,etal.Microsatellite discovery by deep sequencing of enriched genomic libraries[J].Biotechniques,2009,46(3):217.

[3] Selkoe K A,Toonen R J.Microsatellites for ecologists:a practical guide to using and evaluating microsatellite markers[J].Ecology Letters,2006,9(5):615-629.

[4] Zane L,Bargelloni L,Patarnello T.Strategies for microsatellite isolation:a review[J].Molecular Ecology,2002,11(1):1-16.

[5] 林能鋒,蘇永全,丁少雄,等.大黃魚微衛星標記引物在石首魚科幾個近緣種中的通用性研究[J].中國水產科學,2008,15(2):237-243.

[6] 葉林江,王靜,孫鵬,等.四種栲屬植物微衛星標記在鉤栲中的通用性檢測[J].植物分類與資源學報,2014,36(4):443-448.

[7] 邵偉偉,華攀玉,周善義,等.棕果蝠微衛星位點的篩選及其對近緣種的通用性[J].獸類學報,2007,27(4):385-388.

[8] 李華.中國鼢鼠亞科的分類研究[J].首都師范大學學報(自然科學版),1995,16(l):75-80.

[9] 蘇軍虎,紀維紅,南志標,等.鼢鼠亞科Mysopalacinae動物系統學研究現狀與展望[J].動物學雜志,2015,50(4):649-658.

[10] 施銀柱,邊疆暉,王權業.高寒草甸地區小哺乳動物群落多樣性的初步研究[J].獸類學報，1991,11(4):279-97.

[11] 崔慶虎,蔣志剛,劉季科,等.青藏高原草地退化原因述評[J].草業科學,2007,24(5):20-26.

[12] 劉錦上,張衛國,江小蕾,等.高原鼢鼠的洞道空間對高寒草甸植被性狀的影響[J].草地學報,2011,19(6):927-932.

[13] Zhang Y M,Zhang Z B,Liu J K.Burrowing rodents as ecosystem engineers:the ecology and management of plateau zokors Myospalax fontanierii in alpine meadow ecosystems on the Tibetan Plateau[J].Mammal Review,2003,33(3-4):284-294.

[14] 鐘文勤,樊乃昌.我國草地鼠害的發生原因及其生態治理對策[J].生物學通報,2002,37(7):1-4.

[15] 蘇軍虎,南志標,紀維紅.家畜放牧對草地嚙齒動物影響的研究進展[J].草業學報,2016,25(11):136-148.

[16] 王海芳,蘇軍虎,劉榮堂,等.基于線粒體ND4基因的鼢鼠系統進化關系[J].草原與草坪,2008,129(4):20-23.

[17] Begall S,Burda H,Schleich C E.Subterranean rodents:news from underground[M].Springer Berlin Heidelberg,2007.

[18] 王靜,紀維紅,徐長林,等.達烏爾黃鼠線粒體Cyt b基因序列特征及其系統進化分析[J].草原與草坪,2016,36(3):17-22.

[19] Karanth K P,Avivi A,Beharav A,etal.Microsatellite diversity in populations of blind subterranean mole rats (Spalax ehrenbergi,superspecies) in Israel:speciation and adaptation[J].Biological Journal of the Linnean Society,2004,83(2):229-241.

[20] 蘇軍虎.青藏高原東緣兩類典型土著動物種群遺傳結構分析[D].蘭州：甘肅農業大學,2014.

[21] 蘇軍虎,張艷萍,婁忠玉,等.甘肅金鱒AFLP體系建立及應用[J].中國農學通報,2011,27(7):400-404.

[22] Botstein D,White R L,Sckolnick M,etal.Construction of agenetic linkage map in man using restriction fragment lengthpolymorphism [J].Am J Hum Genetic,1980,32(3):314-331.

[23] Nei M.Genetic distance between populations [J].Am Nat,1972,106:283-292.

[24] Crow A J,Kimura M.Evolution in sexual and asexual population[J].Am Nat,1965,99:439-450.

[25] 鄒喻蘋,葛頌,王曉東.系統與進化植物學中的分子標記[M].北京:科學出版社,2001.

[26] 孫波,鮑毅新,張龍龍,等.大鼠及小鼠微衛星引物在社鼠中的跨種擴增[J].動物學雜志,2009,44(6):145-150.

[27] 陳昌文,曹珂,王力榮,等.中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構建[J].中國農業科學,2011,44(10):2081-2093.