畢赤酵母基因工程菌發酵生產抗菌肽工藝分析

韋忠明

摘 要：當前，我國經常會出現濫用抗生素的現象，導致患者的生命安全受到極大威脅，誘發多種微生物菌株，且在發明新抗生素的時候，需耗費很長時間，無法滿足當前的發展需求，因此，為了提升抗生素藥物的安全性，下文針對畢赤酵母基因工程菌發酵生產中的抗菌肽工藝進行分析，以實驗的方式表達，得出準確的結論，以供參考。

關鍵詞：畢赤酵母基因工程；菌發酵生產；抗菌肽工藝

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）07-0220-01

抗菌肽屬于新型的抗菌藥物，屬于具有較大潛力的抗生素替代制劑，當前，我國已經研究出將近一千種抗菌肽，每種都具備特殊的抗菌機理，與抗生素相較，不容易產生耐藥性，熱穩定較高，因此，需合理使用抗菌肽，代替抗生素藥物。

1 實驗中的材料與方式

1.1 材料分析

本次實驗之前構建了抗菌肽畢赤酵母基因工程菌LY，并使用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為實驗材料。實驗中選擇的試劑為酵母粉、蛋白胨、天門冬氨酸、三氯乙酸、甲醇試劑、氯化鈉試劑與葡萄糖試劑。

1.2 明確培養基的配方

在實驗中，主要使用的為酵母種子與固體兩種培養基類型。前者的配方為：酵母粉（1%）、蛋白胨（2%）、葡萄糖（3%），且pH值呈現自然的狀態。后者培養基的配方為：酵母粉（0.6%）、蛋白胨（1.1%）、氯化鈉（1.1%）、瓊脂粉（2.1%），且pH值呈現自然的狀態。

1.3 具體的實驗方式分析

1.3.1 對菌株的重組進行誘導表達

可篩選陽性的酵母菌株，將其放置在YPD液體中實現一級培養，液體劑量為5ml，溫度為30攝氏度，以每分鐘200r的速度振蕩，在等于2的時候，取出1ml培養液，在YPD中重新培養，繼續振蕩，24個小時之后加入濃度為1.1%的甲醇，并培養48個小時，然后以每分鐘8000r的速度進行離心，時間為10分鐘，針對表達上清液進行全面的收集，并取出的表達上清液，實現抑菌實驗工作。在抑菌實驗中，使用21%的三氯乙酸溶液針對上清液進行沉淀，然后加入4攝氏度左右的注射用水，以每分鐘14000r的速度進行離心，時間為20分鐘，針對沉淀物進行收集，然后放置在0.6ml的PBS溶液中進行處理，在電泳分析的情況下，明確三分子多肽的實際表達產物情況。

1.3.2 利用瓊脂擴散方式針對抗菌肽的抑菌活性進行測定

篩選對數生長期中的大腸桿菌與金色葡萄球菌，并制作成為浮液，各自為15，將其與LB固體培養基均勻攪拌，固體培養基的溫度為56攝氏度，劑量為31ml，然后平鋪在平板中，在溶液凝固之后，在平板上面放置牛津杯，然后將已經保存的上清液放置在牛津杯中，劑量為100，在此期間，可以將平板設置在溫度為37.5攝氏度的恒溫培養箱中，待過夜之后，將其與體積相同且空載體轉化的酵母上清液進行隱性對照，在第二天的時候，合理仔細觀察抑菌圈，并記錄大小數據，確保實驗的準確性。

1.3.3 針對抗菌肽的表達培養基相關配方進行合理優化處理

本實驗可以使用四個因素、三個水平進行正交實驗，制定完善的設計方案，在正交試驗的過程中，全面觀察培養基中碳源對菌株相關抗菌肽表達方式的影響情況。如果酵母膏的濃度為1%、蛋白胨的濃度為2%，就可以針對谷氨酸與天冬氨酸的實際情況進行分析，了解其對于菌株抗菌肽實際表達的影響情況。

1.3.4 針對抗菌肽的實際表達條件進行合理的優化

在優化抗菌肽實際表達條件的時候，可以使用三種方式。其一，了解培養基的pH值，在充足抗菌肽方面的表達影響情況。其二，了解不同甲醇濃度的表達影響。其三，了解發酵時間的表達影響[1]。

2 實驗結果

2.1 針對抗菌肽進行表達

在實驗之后可以發現，通過空載體酵母與重組酵母的分析，可以得到上清液蛋白的具體結果，其中，重組酵母上清液中，主要蛋白質條帶分子量在4.1kda左右，而對于空載體的酵母而言，在陰性對照期間，沒有條帶，因此，需合理使用實驗方式。

2.2 不同碳源的實際影響情況

在酵母菌抗菌肽表達方面，不同碳源會對其造成不同的影響。在正交實驗的過程中，空白R數據為0.07，而葡萄糖R數據為0.08，可以說明，葡萄糖碳源對于抗菌肽的表達情況所產生影響很小。對于甘油而言，R數據為0.56，屬于幾種碳源中，對抗菌肽表達情況影響最大的元素[2]。

2.3 谷氨酸與天冬氨酸的實際影響分析

使用正交實驗方式，針對酵母粉與蛋白胨等進行研究，了解此類有機氮源在酵母抗菌肽表達方面的實際影響情況，可以發現，有機氮源對其產生的影響很小，且在實驗中，可以嘗試添加不同的氨基酸，利用氨基酸的表達方式，協調天冬氨酸表達，以此提高抗菌肽表達的靈活性。在實驗中可以發現，0.26%谷氨酸制劑與0.6%天冬氨酸制劑會促進抗菌肽的表達，但是，繼續增加濃度，不會產生明顯的促進效果[3]。且在使用0.26%谷氨酸的時候，抑菌圈的直徑可以達到1.9cm左右，而使用0.6%的天冬氨酸，抑菌圈的直徑在1.75cm左右，且谷氨酸的價格很低，因此，在實際實驗的過程中，可將谷氨酸作為主要的氮源，并將濃度控制為0.26%。

2.4 表達條件實際優化分析

在使用甲醇材料的時候，需在不同濃度、pH值與發酵時間的條件之下進行比較與研究，在實驗的過程中可以發現，將酵母菌轉結到培養基（pH5.5）中，將培養時間控制在24小時，之后添加1.5%的甲醇材料，在30攝氏度的空間中培養72小時，可得到最高的抗菌肽表達成效[4]。

2.5 優化之前與之后發酵液對抑菌活性的影響對比

在實驗的過程中，需針對培養基的優化結果進行對比，可實現檸檬酸銨、蛋白胨與酵母膏之間的發酵，在了解發酵工藝條件的情況下，明確最終的結果。在實驗中發現，使用革蘭陽性的金色葡萄球菌進行實驗，優化之后的抗菌肽效果比優化之前高出57%左右，且在實驗中也可以發現，革蘭陰性大腸桿菌會受到抗菌肽的抑制性影響，且優化之后比優化之前的效果高出63%左右。

通過本次實驗，可以了解到革蘭陰性與陽性菌會受到抗菌肽的抑菌作用，屬于廣譜的抗菌肽，且在研究中表面，利用發酵培養基與相關工藝技術的優化方式，能夠促進酵母菌株的抗菌肽表達，并形成良好的處理依據，可全面優化具體的實驗模式[5]。

3 結語

當前，我國經常會出現濫用抗生素的現象，導致抗生素的使用效果降低，甚至誘導多種抗生素的抗性菌株增加，且我國在新型抗生素方面，開發與研究需要很長時間，耗費的成本也很高，無法與耐藥性菌株的臨床發展速度相較，導致人們的身體健康受到嚴重威脅，這也導致人們在安全驅使之下，迫切追求新型的抗菌制劑。而抗菌肽屬于新型抗菌藥物，可以成為抗生素的替代制劑，當前，我國已經得到了抗菌肽的研究成果，并在實際研究中，實現抗菌譜的優勢，因此，在臨床治療發展中具備很高的發展前景。上述實驗已經得出了準確的結論，可以形成借鑒性。

參考文獻

[1]郝思怡.金環蛇抗菌肽Cath-BF在畢赤酵母中的組成型分泌表達[D].廣東藥學院，2015.

[2]王爾群.雞AvBD6成熟肽在畢赤酵母中的表達及其抗菌活性分析[D].安徽農業大學，2016.

[3]魏海婷.AvBD2在畢赤酵母中的組成型表達及其發酵條件優化[D].安徽農業大學，2015.

[4]阮海寧.生物轉化法生產谷胱甘肽的工藝研究[D].浙江大學，2014.

[5]郭晉霞.重組雙堿基內肽酶在畢赤酵母中的表達制備及酶活鑒定[D].重慶理工大學，2016.